Progressi nella segmentazione automatizzata delle vescicole sinaptiche

Le cellule sono i mattoni di tutti gli esseri viventi. Hanno molte parti importanti, ognuna con una funzione specifica. Per studiare questi minuscoli componenti e il loro arrangiamento, gli scienziati usano una tecnica chiamata crio-tomografia elettronica (cryo-ET). Questo metodo consente ai ricercatori di scattare foto dettagliate delle cellule mantenendo intatte le loro strutture e in uno stato naturale e acquoso.

Quando gli scienziati guardano le cellule, spesso si concentrano su grosse molecole chiamate macromolecole. Se ci sono abbastanza copie di queste molecole nelle immagini scattate con cryo-ET, i ricercatori possono determinare la loro struttura dettagliata proprio dove devono trovarsi all'interno della cellula. Tuttavia, analizzare queste immagini può essere complicato. Questo è in parte perché i campioni biologici usati possono essere sensibili ai fasci di elettroni utilizzati nell'imaging, il che può portare a dati "rumorosi".

Per creare un'immagine 3D di una cellula, vengono scattate più foto da angolazioni diverse. Purtroppo, l'angolo da cui è possibile scattare immagini è limitato a causa della forma dei campioni, portando a lacune nelle informazioni. Questo problema, noto come artefatto della cuneo mancante, rende difficile ottenere immagini chiare, specialmente di strutture completamente circondate da membrane.

Una parte interessante della cellula è la sinapsi. Questo è un'area specializzata in cui le cellule cerebrali, o neuroni, comunicano tra loro. La sinapsi è composta da due parti: l'area presinaptica, dove iniziano i segnali, e l'area postsinaptica, dove i segnali vengono ricevuti. I neuroni inviano segnali tramite il rilascio di sostanze chimiche chiamate Neurotrasmettitori, che sono immagazzinate in piccole confezioni conosciute come Vescicole Sinaptiche (SVs). Il numero di SV disponibili per l'uso e la facilità con cui possono rilasciare il loro contenuto dipende dalle loro interazioni tra loro, che sono guidate da strutture chiamate connettori.

Analizzare come funzionano questi connettori può essere fatto con un software chiamato Pyto, che aiuta a organizzare e identificare queste strutture. Tuttavia, per usare Pyto in modo efficace, i ricercatori devono prima identificare con precisione le SV. Attualmente, questo processo viene fatto a mano, il che può richiedere a un individuo diversi giorni per completarlo per un solo set di immagini. Anche se ci sono stati tentativi di automatizzare questo processo, i metodi precedenti non hanno fornito risultati soddisfacenti.

Per affrontare questo problema, i ricercatori hanno deciso di utilizzare un approccio diverso basato sull'apprendimento profondo, che è un tipo di intelligenza artificiale. Una delle tecniche utilizzate nell'apprendimento profondo si chiama reti neurali convoluzionali (CNN). Queste reti sono state applicate con successo per segmentare immagini in studi simili. Anche se questo metodo è stato utile per scopi visivi, non ha ancora soddisfatto le esigenze di identificazione accurata delle strutture in Pyto.

Alcuni studi hanno mostrato che le CNN possono fornire buoni risultati per analizzare immagini 2D delle sinapsi, ma i dati 3D presentano le proprie sfide. Tipicamente, nella cryo-ET, le immagini 2D vengono separate e analizzate indipendentemente, il che può portare a perdere contesti importanti dalle altre immagini. Questo porta a lacune in cui le SV rotonde sembrano essere aperte quando dovrebbero essere chiuse. Per risolvere questo, i ricercatori hanno creato un passaggio di adattamento utilizzando metodi statistici, che hanno aiutato ad aggiustare l'aspetto di queste strutture.

Il miglior metodo per gestire le immagini 3D è usare una versione 3D delle CNN. Alcuni studi hanno già provato ad applicare reti 3D ad altri compiti nella cryo-ET, ma nessuno si è concentrato sul segmentare le membrane in grande dettaglio.

Così, i ricercatori hanno scelto di utilizzare un tipo specifico di CNN 3D chiamato U-Net. Questo tipo di rete ha dimostrato di ripristinare dettagli persi in immagini rumorose. Anche se questo approccio è stato utile per alcune analisi, non ha ancora fornito il livello di accuratezza necessario per Pyto. I ricercatori hanno poi sviluppato un metodo di post-elaborazione per affinare i risultati dopo la segmentazione iniziale.

Questo nuovo metodo ha coinvolto il cambiamento degli oggetti segmentati in sfere e l'aggiustamento delle loro dimensioni e posizione. Il processo include l'identificazione e la correzione di eventuali errori, portando a una rappresentazione più accurata delle SV. Con questo miglioramento, i risultati sono diventati comparabili a quelli ottenuti attraverso la segmentazione manuale.

Anche se questo sistema è stato originariamente creato per le SV, può essere applicato anche ad altri tipi di vescicole nelle cellule, come le vescicole di trasporto e le vescicole secernenti. Inoltre, con piccole modifiche, potrebbe segmentare accuratamente altre strutture racchiuse nelle membrane o persino la membrana cellulare.

#Addestramento del Modello di Segmentazione

Date le sfide associate alla segmentazione manuale delle SV, i ricercatori miravano ad automatizzare il processo. In precedenza, avevano segmentato manualmente diversi set di immagini, che hanno utilizzato come riferimento per addestrare il loro modello. Hanno addestrato l'U-Net utilizzando un gruppo di 9 immagini segmentate di sinaptosomi di ratto.

Per confermare l'efficacia del loro nuovo pipeline, sono state analizzate tre serie di immagini. Il processo inizia dividendo le immagini in sezioni più piccole, quindi alimentandole nella rete di segmentazione. Dopo aver ottenuto una maschera di probabilità, i ritagli vengono riuniti per creare una maschera completa. Questa maschera completa viene poi affinata per migliorare l'accuratezza.

Inizialmente, alcune vescicole non erano segmentate correttamente. Alcune erano erroneamente identificate come un'unica entità quando in realtà erano vicine tra loro. Per rimediare a questo, i ricercatori hanno regolato le impostazioni di rilevamento. Hanno anche scoperto che alcuni segmenti contenevano solo una parte di una vescicola, il che richiedeva di cambiare le impostazioni per catturare con maggiore precisione l'intera vescicola.

Dopo il processo di segmentazione, i ricercatori hanno notato che mentre i risultati iniziali sembravano buoni, c'erano ancora problemi. A volte, le vescicole apparivano troppo piatte o non centrate nel segmento. Per affinare questi segmenti, ogni vescicola è stata rappresentata come una sfera, e i ricercatori hanno lavorato per perfezionare il suo centro e il suo raggio.

I ricercatori hanno esaminato l'intensità attorno al centro di ciascuna sfera e hanno fatto aggiustamenti per garantire che le vescicole segmentate corrispondessero alle loro forme reali. Questo processo è stato fondamentale per fornire una rappresentazione più accurata delle vescicole nelle immagini.

Nonostante i miglioramenti, alcuni problemi sono rimasti. Misurando diverse caratteristiche delle vescicole segmentate, i ricercatori hanno identificato valori anomali che non si adattavano ai modelli previsti. Utilizzando tecniche statistiche, sono stati in grado di rilevare e affinare questi segmenti anomali.

#Valutazione delle Prestazioni

I ricercatori hanno valutato quanto bene funzionasse il loro metodo confrontando i risultati della loro segmentazione con il riferimento manuale. Hanno utilizzato una misura chiamata Coefficiente di Dice per valutare la somiglianza tra i segmenti previsti e quelli reali. I risultati hanno mostrato che il loro metodo ha migliorato significativamente l'accuratezza, in particolare dopo i passaggi di post-elaborazione.

Inoltre, il team ha anche verificato che il loro metodo potesse essere applicato a immagini provenienti da fonti diverse, dimostrando la sua versatilità. Questo significa che potrebbe essere utilizzato non solo per i sinaptosomi dei ratti ma anche per diversi tipi di cellule.

#Vantaggi del Nuovo Metodo

Il passaggio dalla segmentazione manuale a quella automatizzata è cruciale perché i metodi tradizionali possono essere lenti e limitati nel campo di applicazione. Con il nuovo sistema, i ricercatori possono ora analizzare sinapsi intere molto più velocemente di prima. Inoltre, l'approccio automatico consente un'area di analisi più ampia rispetto ai metodi manuali che spesso limitavano il focus a un'area ristretta.

I ricercatori hanno integrato il loro modello di segmentazione con uno strumento interattivo che consente agli utenti di correggere facilmente eventuali errori. Questa flessibilità garantisce i risultati finali più accurati.

Un software chiamato Pyto è progettato per analizzare immagini 3D complesse, specialmente nello studio delle sinapsi. Può rilevare connettori e legami che svolgono un ruolo cruciale nella funzione sinaptica. CryoVesNet, il nuovo strumento di segmentazione sviluppato, funziona senza problemi con Pyto, fornendo informazioni preziose su come interagiscono le vescicole.

#Conclusione

Il progresso nella segmentazione automatica nella cryo-ET segna un miglioramento significativo nel modo in cui gli scienziati studiano le vescicole sinaptiche e le loro strutture correlate. La combinazione di apprendimento profondo e tecniche di post-elaborazione efficienti fornisce una soluzione efficace e precisa per i ricercatori. Man mano che questo campo di studio avanza, gli strumenti che facilitano approfondimenti più profondi nelle strutture cellulari diventeranno sempre più importanti per migliorare la nostra comprensione dei processi biologici.