Migliorare le tecniche di imaging con filamenti di DNA a doppia etichetta

Le filamenti di DNA etichettati con fluorofori sono strumenti importanti usati nelle tecniche avanzate di microscopia. Questi piccoli filamenti aiutano gli scienziati a vedere cose molto piccole, come le strutture nelle cellule, in modo più chiaro. Quando sono combinati con metodi di imaging speciali, permettono di ottenere immagini migliori dei campioni biologici.

#Tecniche Chiave

Alcune delle tecniche avanzate di microscopia che utilizzano questi filamenti di DNA includono:

• Microscopia di Localizzazione a Singolo Molecola (SMLM): Questo metodo aiuta a identificare dove si trovano singole molecole in un campione.
• Accumulo di Punti di DNA in Topografia Nanoscalare (DNA-PAINT): Questa tecnica usa brevi filamenti di DNA per creare immagini dettagliate delle strutture.
• Imaging a Fluttuazione Ottica di Super-Risoluzione (SOFI): Questo metodo fornisce immagini ad alta risoluzione analizzando le fluttuazioni della luce.
• Microscopia a Emissione Stimolata di Deplezione (STED): Questa tecnica offre immagini di super-risoluzione usando un modello di luce speciale per spegnere i segnali di fondo.

Un grande vantaggio dell'uso di questi filamenti di DNA è la loro capacità di etichettare più bersagli contemporaneamente. Lavando via e riaggiungendo diversi filamenti etichettati, gli scienziati possono fare immagini ripetute che aiutano a costruire un quadro più completo del campione.

#Ottimizzare l'Imaging con Etichette DNA

Un vantaggio specifico di DNA-PAINT è che permette agli scienziati di misurare quanto di una specifica molecola è presente. Questo può essere fatto attraverso un processo chiamato analisi cinetica. Tuttavia, usare etichette di DNA a bassa affinità può portare a delle sfide. Queste etichette devono rimanere nel tampone di imaging durante gli esperimenti, il che può aumentare il rumore di fondo e rallentare l'acquisizione delle immagini.

Per affrontare questo problema, gli scienziati hanno introdotto fluorofori quenching FRET. Questi sono tipi speciali di fluorofori che, quando collegati a filamenti di DNA più lunghi, possono ridurre il rumore di fondo. Recentemente, gli scienziati hanno mostrato che usare filamenti di DNA a entrambe le estremità con fluorofori identici può portare a un auto-quenching. Ciò significa che quando i filamenti non sono legati al loro bersaglio, mostrano una fluorescenza più bassa, portando a immagini più chiare.

#Caratterizzazione di Nuovi Probi

Gli scienziati hanno progettato diversi nuovi filamenti di DNA etichettati con fluorofori, noti come "filamenti di imaging." Hanno usato una sequenza di DNA comune e attaccato fluorofori alle estremità o solo a un'estremità. I fluorofori scelti per questo studio erano Cy3B, silicio-rhodamina (SiR) e tetrametilrhodamina (TMR).

Hanno caratterizzato questi filamenti esaminando il loro comportamento in soluzione quando sono singoli e quando si legano a un filamento complementare. Guardando le loro proprietà di assorbimento e fluorescenza, potevano vedere quanto fossero efficaci questi nuovi filamenti.

#Osservazioni

Quando i filamenti di imaging portano due fluorofori, i loro segnali fluorescenti cambiano quando sono liberi in soluzione rispetto a quando sono legati a un bersaglio. In particolare, il segnale di fluorescenza aumenta notevolmente al momento del legame, indicando che i filamenti etichettati dualmente sono efficaci per l'imaging.

Hanno anche osservato cambiamenti nella velocità con cui i filamenti si legano e si staccano dai loro bersagli, il che aiuta a determinare quanto tempo rimangono attaccati durante l'imaging.

#Uso nella Microscopia STED

I nuovi filamenti di imaging etichettati dualmente sono stati testati nella microscopia STED, dove si sperava che riducessero la fluorescenza di fondo vista nei probabili non legati. I risultati precedenti indicavano che certe combinazioni di filamenti etichettati dualmente riducevano efficacemente il rumore di fondo aumentando la luminosità dei probabili legati.

Le immagini ottenute mostravano che mentre alcuni filamenti mostravano una diminuzione dell'intensità di fluorescenza quando legati, tutti i filamenti etichettati dualmente mostravano segnali di fondo più bassi rispetto ai loro omologhi etichettati singolarmente. Questo ha portato a un miglior rapporto segnale-rumore per ogni filamento etichettato dualmente usato nell'imaging.

Inoltre, l'aumento del rapporto segnale-rumore era accompagnato da un miglioramento della risoluzione delle immagini. Questo miglioramento significa che gli scienziati potevano distinguere dettagli più piccoli nei loro campioni.

#Imaging a Due Colori

Utilizzare filamenti etichettati dualmente ha anche permesso agli scienziati di condurre imaging simultaneo a due colori. Questo significa che potevano visualizzare due diverse strutture in un solo esperimento, il che fornisce informazioni ancora più ricche sulla biologia studiata.

#Avanzare nella Microscopia DNA-PAINT

Gli scienziati hanno anche applicato questi filamenti di imaging etichettati dualmente alla microscopia DNA-PAINT. Si sono concentrati su Cy3B e SiR, noti per la loro stabilità e separazione spettrale. Confrontando le prestazioni di filamenti etichettati singolarmente e dualmente in strutture di origami di DNA, sono stati in grado di valutare quanto bene questi filamenti funzionassero insieme.

I risultati hanno indicato che i filamenti etichettati dualmente offrivano proprietà di fluorescenza migliorate, portando a risultati di imaging migliori. L'aumento della resa di fotoni era significativo, e i filamenti etichettati dualmente fornivano una risoluzione migliorata.

#Visualizzazione delle Strutture Biologiche

Utilizzando i filamenti di imaging etichettati dualmente, gli scienziati hanno visualizzato strutture importanti come la proteina del complesso del poro nucleare Nup96. Hanno confrontato la produzione di fotoni di filamenti etichettati singolarmente e dualmente, confermando che i filamenti etichettati dualmente fornivano più fotoni e un miglior dettaglio d'immagine.

#Conclusione

Questa ricerca sottolinea come i dimers auto-quenching attaccati a brevi filamenti di DNA possano migliorare significativamente l'imaging nelle tecniche avanzate di microscopia. Utilizzando sonde di DNA etichettate dualmente, gli scienziati possono ottenere rapporti segnale-sfondo più elevati e una risoluzione d'immagine migliorata.

Le implicazioni di questo lavoro si estendono oltre un'area della microscopia. I principi che governano questi filamenti etichettati dualmente potrebbero essere adattati per altre tecniche, portando a ulteriori progressi nell'imaging biologico. Alla fine, questa ricerca apre la strada a osservazioni più precise dei processi e delle strutture biologiche a livello molecolare.