Sviluppi nelle Tecniche di Tomografia Crio-Elettronica

La crio-tomografia elettronica (cryo-ET) è uno strumento potentissimo per studiare le connessioni tra la struttura e la funzione di grandi molecole nelle cellule. Di recente, un metodo che combina cryo-ET con la fabbricazione di lamelle tramite fasci ionici focalizzati (FIB) ha mostrato grandi potenzialità nel migliorare la nostra capacità di osservare queste strutture. Migliorando il modo in cui prepariamo i campioni e raccogliamo i dati, i ricercatori possono visualizzare i macromolecole a un livello molto dettagliato, il che aiuta a capire i loro ruoli nei processi biologici.

#L'importanza della preparazione del campione

La qualità del campione è fondamentale nella biologia strutturale. Un campione ben preparato consente ai ricercatori di ottenere immagini più chiare, rivelando dettagli importanti sulla disposizione e le interazioni delle molecole. I metodi tradizionali di preparazione dei campioni spesso presentano varie limitazioni che possono ostacolare la qualità dei risultati. Perciò, c'è uno sforzo continuo per sviluppare nuove tecniche che possano migliorare la risoluzione e l'affidabilità dei dati ottenuti da questi campioni.

#Fabbricazione di lamelle con fasci ionici focalizzati

La fabbricazione di lamelle FIB è un metodo utilizzato per creare fette sottili di campioni biologici per la microscopia elettronica. Più il campione è sottile, più chiare possono essere le immagini catturate. Tuttavia, ci sono delle sfide con questa tecnica, specialmente quando si tratta di materiali biologici complessi o spessi come tessuti o piccoli organismi.

I recenti progressi nel processo di fabbricazione si sono concentrati sull'uso di diversi tipi di sorgenti ioniche per migliorare i tassi di Fresatura e ridurre i danni ai campioni durante la preparazione. Una di queste sorgenti è il plasma di xenon, che ha dimostrato di fornire risultati migliori rispetto alle tradizionali sorgenti di ioni di gallio.

#I benefici delle sorgenti di ioni di xenon

Le sorgenti di plasma di xenon mantengono prestazioni costanti anche ad alti correnti, consentendo una fresatura più veloce dei campioni. Al contrario, le sorgenti di gallio faticano con densità di corrente elevate, limitando la loro efficacia nel trattare campioni più spessi. Gli studi hanno indicato che l'uso del xenon può portare a tassi di fresatura più elevati, il che è un vantaggio significativo quando si preparano campioni per cryo-ET.

Non solo questo metodo riduce i tempi di preparazione, ma diminuisce anche il rischio di danneggiare il campione, cosa che può verificarsi a causa degli impatti ad alta energia degli ioni durante la fresatura.

#Flusso di lavoro per la preparazione del campione

Il processo di preparazione di campioni biologici congelati ad alta pressione con FIB di xenon prevede diversi passaggi:

1. Vitrificazione: I campioni vengono rapidamente congelati per preservare la loro struttura e prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio, che possono disruptare le caratteristiche biologiche del campione.

2. Rimozione del ghiaccio: Prima della fresatura, viene eseguito un passaggio di rimozione del ghiaccio utilizzando fasci di xenon a bassa energia. Questo è cruciale perché la contaminazione da ghiaccio può oscurare le strutture biologiche di interesse.

3. Fresatura delle trincee: Vengono fresate trincee su entrambi i lati del sito della lamella prevista. Questo passaggio di preparazione è essenziale per creare lo spessore giusto che consente un'imaging ad alta risoluzione.

4. Sfinamento finale: Dopo che le trincee sono formate, il materiale sotto il sito della lamella viene rimosso a vari angoli. Questo passaggio assicura che la lamella finale sia abbastanza sottile per la trasparenza elettronica, necessaria per un'imaging di alta qualità.

5. Lucidatura: L'ultimo passaggio prevede la lucidatura della lamella per ottenere la qualità della superficie desiderata, il che migliora ulteriormente la chiarezza dell'immagine.

#Osservazioni dal flusso di lavoro sperimentale

Utilizzando il flusso di lavoro delineato, i ricercatori hanno preparato con successo lamelle da campioni di E. coli e ottenuto una vista dettagliata dei ribosomi a una risoluzione di 4.0 Å. Questo livello di dettaglio consente l'identificazione delle catene laterali degli aminoacidi all'interno della struttura ribosomiale, dimostrando l'efficacia della tecnica di fresatura FIB al plasma di xenon.

#Analisi dei danni

Nonostante i progressi nei metodi di fresatura, i danni ai campioni durante la preparazione rimangono una preoccupazione. Le osservazioni hanno indicato che la fresatura può creare zone prive di caratteristiche biologiche sul retro della lamella. Queste aree colpite consistono tipicamente in strati striati e regioni amorfe, che indicano danni strutturali.

Per indagare l'estensione di questo danno, è stata eseguita un'analisi del fattore B. Questa analisi misura la variabilità nelle posizioni delle particelle, fornendo informazioni sulla qualità strutturale dei ribosomi campionati. I ribosomi situati vicino alle regioni danneggiate hanno mostrato una riduzione del contenuto informativo, ma quelli più lontani sono rimasti invariati.

#Conclusioni dello studio

I risultati sottolineano che, sebbene la fresatura FIB al plasma di xenon possa produrre lamelle di alta qualità per la biologia strutturale, è necessario prestare attenzione al potenziale di danno superficiale. Il metodo consente ai ricercatori di preparare campioni in modo efficiente mantenendo un alto livello di risoluzione. Tuttavia, capire come mitigare i danni e migliorare la qualità della superficie rimane un'area chiave per ulteriori ricerche.

#Direzioni future

Andando avanti, ci sono diverse strade per migliorare questo metodo. Ridurre l'impatto del danno da fresatura sull'analisi strutturale potrebbe essere realizzato attraverso:

• Riduzione della tensione del fascio ionico: Questa tattica ha mostrato promesse nella riduzione della profondità del danno nella scienza dei materiali e potrebbe essere applicata anche negli studi biologici.

• Miglioramento della gestione dei campioni: Sviluppare protocolli migliori per la gestione dei campioni durante la fresatura ionica potrebbe aiutare a preservare la loro integrità.

• Analisi automatizzata dei danni: Implementare sistemi automatizzati per valutare in tempo reale i livelli di danno potrebbe consentire aggiustamenti immediati ai parametri di fresatura.

In generale, la combinazione di tecniche avanzate di preparazione dei campioni e metodi di analisi dettagliati posiziona i ricercatori bene per scoprire i dettagli intricati delle strutture macromolecolari e il loro significato biologico.