Approfondimenti sui meccanismi di rigenerazione degli assoni

Le cellule nervose, o neuroni, comunicano tra loro attraverso delle lunghe estensioni chiamate assoni. Quando questi assoni si danneggiano, la comunicazione tra neuroni e i loro bersagli può essere interrotta, portando alla perdita di funzionalità. Perché i neuroni possano recuperare la loro funzione, questi assoni danneggiati devono rigenerarsi e riconnettersi ai loro bersagli. Tuttavia, questo processo è difficile, specialmente nel sistema nervoso centrale (CNS), anche a causa della presenza di sostanze che inibiscono la ricrescita.

Un’area di interesse per aiutare gli assoni a rigenerarsi è il cono di crescita, che è la struttura all’estremità di un assone in crescita. Il cono di crescita cambia dinamicamente la sua forma per navigare nell’ambiente e trovare i bersagli giusti. Il citoscheletro, che è una rete di proteine dentro la cellula, gioca un ruolo fondamentale in questo processo. Due proteine importanti nel citoscheletro sono l'actina e la miosina, che aiutano il cono di crescita a muoversi e cambiare forma.

#Ruolo dell'Actina e della Miosina nella Crescita degli Assoni

Il citoscheletro è cruciale per regolare la forma e il movimento del cono di crescita. I filamenti di actina possono assemblarsi e disassemblarsi rapidamente, permettendo al cono di crescita di avanzare. Le proteine di miosina aiutano nella contrazione dei filamenti di actina, fornendo la forza necessaria per il movimento. L'attività della miosina è controllata da altre proteine, come la chinasi della catena leggera della miosina (MLCK) e la fosfatasi della catena leggera della miosina (MLCP). La MLCK attiva la miosina aggiungendo un gruppo fosfato, mentre la MLCP rimuove questo gruppo, inattivando la miosina.

Quando un asson è ferito, i livelli di MLCK aumentano, portando a una miosina più attiva e potenzialmente ostacolando la rigenerazione dell'assone. Questo equilibrio dinamico tra attivazione e inattivazione della miosina è cruciale per una ricrescita di successo degli assoni.

#Fattori Inibitori nella Rigenerazione degli Assoni

Dopo un infortunio al nervo, ci sono varie molecole presenti nel sito lesionato che possono inibire la rigenerazione dell'assone. Due gruppi ben noti di questi inibitori sono gli inibitori basati sulla Mielina e i proteoglicani di solfato di condroitina (CSPGs). La mielina è un guscio protettivo attorno ai nervi, e i CSPGs sono molecole presenti nel tessuto cicatriziale che si forma dopo un infortunio. Entrambi possono creare una barriera che impedisce agli assoni di ricrescere correttamente.

La presenza di questi inibitori porta all'attivazione della via di segnalazione RhoA/ROCK, che contribuisce al crollo del cono di crescita. Questo è generalmente sfavorevole per la rigenerazione perché impedisce all'assone di estendersi e trovare il suo bersaglio.

#L'Importanza di MLCK e MLCP nella Rigenerazione

Studi recenti hanno dimostrato che manipolare l'attività di MLCK e MLCP può influenzare la crescita degli assoni. Quando l'attività di MLCK è inibita, gli assoni riescono a crescere meglio su substrati inibitori come i CSPGs e la mielina. Questo suggerisce che controllare l'attività di queste proteine può essere una strategia per migliorare la rigenerazione degli assoni.

Nei nostri studi, abbiamo trovato che dopo un infortunio ai nervi periferici, i livelli di MLCK erano elevati nei neuroni sensoriali. Questo aumento ha portato a livelli più alti di miosina attivata, che ha avuto un impatto negativo sulla crescita degli assoni. Inibire MLCK attraverso mezzi farmaceutici o manipolazione genetica ha portato a un miglioramento nella rigenerazione degli assoni.

Al contrario, quando l'attività di MLCP è inibita, gli assoni hanno mostrato un potenziale rigenerativo migliore. Questo indica che sia MLCK che MLCP svolgono ruoli significativi nel determinare il destino della crescita degli assoni dopo un infortunio.

#Esperimenti e Risultati

Per studiare gli effetti di MLCK e MLCP sulla rigenerazione degli assoni, abbiamo condotto una serie di esperimenti utilizzando neuroni ottenuti da topi. Inizialmente, abbiamo isolato neuroni dei gangli della radice dorsale (DRG) e li abbiamo coltivati in varie condizioni.

#Inibizione di MLCK

Nel nostro primo set di esperimenti, abbiamo trattato i neuroni DRG con ML-7, un inibitore specifico di MLCK. Abbiamo scoperto che il trattamento con ML-7 ha ridotto in modo significativo l'attività della miosina e migliorato la crescita degli assoni nelle colture. La proporzione di neuroni con processi assonici lunghi è aumentata, indicando che l'inibizione di MLCK ha avuto un effetto positivo sulla rigenerazione.

Oltre agli studi in vitro, abbiamo eseguito esperimenti in vivo dove abbiamo utilizzato un metodo chiamato elettroporazione per consegnare siRNA MLCK nei neuroni DRG dei topi. Dopo l'elettroporazione, abbiamo sottoposto il nervo sciatico a un infortunio da schiacciamento. Abbiamo quindi misurato le lunghezze degli assoni in rigenerazione e abbiamo osservato assoni significativamente più lunghi in quelli trattati con siMLCK rispetto ai controlli.

#Attivazione di MLCP

Successivamente, abbiamo esaminato MLCP e i suoi effetti. Utilizzando il pirolo 12,13-dibutirrato (PDBu), che inibisce l'attività di MLCP, abbiamo scoperto che questo trattamento ha anche significativamente aumentato la crescita assonica. Quando coltivati su mielina o CSPGs, i neuroni DRG hanno mostrato una crescita assonica migliorata grazie al trattamento con PDBu. Questo suggerisce che l'inibizione di MLCP può aiutare a superare gli ostacoli nell'ambiente cellulare che inibiscono la rigenerazione.

Per confermare ulteriormente questo, abbiamo anche utilizzato siRNA per silenziare specificamente MYPT1, una proteina regolatrice per MLCP. I risultati hanno mostrato che la riduzione di MYPT1 ha portato a un aumento della fosforilazione della MLC e ha potenziato la crescita degli assoni nei neuroni DRG, sia in vitro che in vivo dopo un infortunio ai nervi.

#Effetti sui Neuroni del Sistema Nervoso Centrale

Mentre i neuroni del sistema nervoso periferico hanno migliori capacità rigenerative, i neuroni del CNS di solito non rigenerano in modo efficace. I nostri studi si sono anche estesi ai neuroni CNS, dove abbiamo trovato che manipolare la via MLCK/MLCP ha impattato in modo simile la crescita. Nei neuroni corticali e ippocampali embrionali, bloccare l'attività di MLCK ha ridotto la crescita degli assoni, mentre inibire MLCP ha portato a una crescita migliorata.

#Inibizione Locale di MLCP

Per vedere l'effetto dell'inibizione locale di MLCP sulla rigenerazione degli assoni in animali vivi, abbiamo condotto esperimenti sulle lesioni del nervo ottico e del midollo spinale. Applicazioni locali di PDBu nel sito di lesione hanno stimolato efficacemente la rigenerazione nel nervo ottico. Dopo l'infortunio, molti assoni rigeneranti sono stati identificati oltre il sito di lesione quando è stato applicato PDBu.

Allo stesso modo, nelle lesioni da schiacciamento del midollo spinale, somministrare PDBu ha ridotto la retrazione degli assoni, un problema comune dopo un infortunio. Abbiamo osservato meno bulbi di retrazione nel gruppo trattato, suggerendo che l'inibizione locale dell'attività di MLCP non solo migliora la rigenerazione ma previene anche la retrazione nei coni di crescita.

#Attività della Miosina II e le Sue Implicazioni

Curiosamente, i nostri risultati hanno indicato che MLCK potrebbe regolare la crescita degli assoni indipendentemente dal ruolo tradizionale della miosina II. L'inibizione della miosina II attraverso un farmaco chiamato blebbistatin ha stimolato la crescita degli assoni. Tuttavia, quando combinato con ML-7, l'effetto inibitorio di ML-7 sulla crescita è persistito. Questo suggerisce che il ruolo di MLCK nella rigenerazione degli assoni potrebbe coinvolgere meccanismi indipendenti dall'attivazione della miosina II.

I nostri risultati implicano che l'influenza di MLCK sulla rigenerazione degli assoni potrebbe coinvolgere interazioni con l'actina e il network del citoscheletro in modo più ampio. Alterando le dinamiche locali dell'F-actina nel cono di crescita, MLCK potrebbe facilitare un miglior comportamento del cono di crescita e promuovere l'allungamento dell'assone.

#Conclusione

In sintesi, la nostra ricerca evidenzia i ruoli critici di MLCK e MLCP nella rigenerazione degli assoni. Regolando l'attività di queste proteine, possiamo influenzare quanto bene gli assoni possono crescere e riconnettersi dopo un infortunio. Le intuizioni ottenute da questo studio potrebbero portare a nuove strategie terapeutiche per migliorare la rigenerazione degli assoni sia negli infortuni del sistema nervoso periferico che centrale.

Manipolare le dinamiche del cono di crescita, soprattutto concentrandosi sui componenti del citoscheletro e i loro regolatori, potrebbe offrire vie promettenti per ripristinare le funzionalità perse dopo infortuni ai nervi. Studi futuri dovranno approfondire i meccanismi specifici attraverso cui queste proteine esercitano i loro effetti, portando potenzialmente a trattamenti innovativi per i danni nervosi.