Nuovo metodo per il barcoding unico delle cellule

La codifica cellulare è un metodo usato per etichettare le singole cellule in un modo unico. Questa etichettatura aiuta gli scienziati a rispondere a molte domande su come funzionano e si comportano le cellule in diverse situazioni. Seguendo queste cellule etichettate, i ricercatori possono studiare come cambiano nel tempo, come si sviluppano diversi tipi di cellule e come certi cambiamenti genetici influenzano una cellula. I due principali tipi di etichette usate in questo processo sono fatte da piccole molecole fluorescenti o da pezzi di DNA. Ogni tipo di etichetta ha i suoi vantaggi e svantaggi. Un metodo di etichettatura ideale consentirebbe molte etichette uniche, sarebbe veloce ed economico da analizzare e permetterebbe agli scienziati di osservare le stesse cellule più volte senza danneggiarle.

#Codici a barre fluorescenti

I codici a barre fluorescenti sono creati usando combinazioni di molecole fluorescenti. Questi codici sono facili e veloci da leggere usando macchine come citometri a flusso o microscopi. Tuttavia, di solito non offrono tanta diversità quanto i metodi di codifica basati sul DNA. Il vantaggio dei codici a barre fluorescenti è che possono fornire osservazioni in tempo reale senza danneggiare le cellule. D'altra parte, i codici a barre di DNA possono creare un numero vasto di etichette uniche. Ad esempio, solo dieci basi di DNA possono produrre circa un milione di combinazioni diverse. La sfida con i codici a barre di DNA è che spesso richiedono processi complessi e che richiedono tempo per essere letti, e le letture possono danneggiare le cellule, limitando così le osservazioni ripetute.

#Nuovo metodo di codifica: MuSIC

Recentemente, è stato proposto un nuovo metodo chiamato MuSIC, che combina i benefici dei codici a barre fluorescenti e di quelli basati sul DNA. In questo approccio, gli scienziati usano combinazioni di proteine fluorescenti per creare spettri unici che possono essere identificati. Questo documento presenta i risultati iniziali dell'uso di questo metodo per creare una libreria di codici a barre realizzati con diverse proteine fluorescenti.

#Costruzione di una libreria di codici a barre

La ricerca ha coinvolto la creazione di una libreria di circa 150 codici a barre unici da 18 diverse proteine fluorescenti. Ogni codice a barre è formato combinando due di queste proteine fluorescenti. I ricercatori hanno prima preparato due set di sonde, ognuna contenente una delle proteine fluorescenti. Hanno poi utilizzato un approccio di clonazione combinato, che consente di combinare efficientemente più proteine fluorescenti. Dopo aver convalidato che tutte le combinazioni attese erano presenti, i risultati hanno mostrato che la libreria conteneva ogni possibile accoppiamento delle proteine fluorescenti, tranne uno.

#Test dei codici a barre

Per vedere quanto bene funzionassero questi codici a barre, i ricercatori hanno trasfettato cellule di mammifero con i codici a barre e hanno usato la citometria a flusso per analizzare i risultati. I dati hanno mostrato che la maggior parte dei codici a barre testati poteva essere identificata accuratamente, con alcune combinazioni che raggiungevano tassi di veri positivi superiori al 99%. Questo significa che il metodo di codifica può distinguere in modo affidabile tra diverse cellule codificate.

#Sfide di identificazione

Nonostante il successo, ci sono state alcune sfide nell'identificare certi codici a barre. Alcune combinazioni di proteine fluorescenti, come mClover3 e mPapaya, venivano spesso mal identificate. I ricercatori hanno notato che la bassa intensità di fluorescenza nelle cellule contribuiva anche a classificazioni errate, in particolare con una proteina fluorescente, mTFP1. Impostando una soglia minima di fluorescenza, hanno migliorato l'accuratezza nell'identificazione dei codici a barre e ridotto la complessità dell'analisi.

#Implicazioni per la ricerca futura

I risultati di questo studio suggeriscono che il metodo MuSIC ha il potenziale per un'alta diversità e una classificazione efficiente dei codici a barre. Questo metodo potrebbe essere combinato con tecniche di screening genetico per analizzare rapidamente molti geni diversi o per tracciare la linea di numerosi cloni cellulari. In generale, apre nuove opportunità per indagare sul comportamento delle cellule e le interazioni in modi che in passato erano limitati da altri metodi di codifica.

#Costruzione e validazione della libreria di codici a barre

I ricercatori si sono concentrati sulla costruzione di una libreria di codici a barre MuSIC sfruttando i vantaggi di due proteine fluorescenti per codice a barre. Hanno creato due librerie separate per le sonde, ognuna contenente le proteine fluorescenti. Utilizzando una strategia di costruzione specifica, sono riusciti a generare una libreria combinata di codici a barre. Hanno confermato che la libreria era diversificata e conteneva quasi tutte le possibili combinazioni delle proteine fluorescenti selezionate.

#Progettazione sperimentale e metodologia

Per valutare l'efficacia dei codici a barre, il team ha condotto una serie di esperimenti utilizzando cellule di mammifero. Hanno selezionato e trasfettato con attenzione cellule con codici a barre MuSIC specifici e poi hanno analizzato le cellule utilizzando la citometria a flusso. Hanno esaminato con quale accuratezza i codici a barre potessero essere riconosciuti, confrontando i dati spettrali con riferimenti noti.

#Analisi della citometria a flusso

La citometria a flusso si è dimostrata uno strumento essenziale in questo studio. Ha permesso ai ricercatori di analizzare gli spettri di emissione delle cellule, fornendo informazioni su quali codici a barre erano presenti. L'analisi ha coinvolto l'identificazione dei picchi principali negli spettri di emissione per dedurre i codici a barre specifici per ogni cellula. Quantificando i tassi di veri positivi e falsi positivi, i ricercatori hanno potuto valutare l'affidabilità di ciascun codice a barre.

#Direzioni future

Sebbene lo studio abbia mostrato risultati promettenti, ci sono diverse aree di miglioramento. Una direzione riguarda l'ampliamento della dimensione e della diversità della libreria aumentando il numero di proteine fluorescenti utilizzate ed esplorando combinazioni più complesse. Potrebbero anche essere adottati progressi nelle tecniche di apprendimento automatico per migliorare il rilevamento e la classificazione dei codici a barre.

#Conclusione

Il metodo MuSIC apre una nuova strada per la codifica cellulare che combina i punti di forza degli approcci a fluorescenza e a DNA. Con la capacità di creare una grande libreria di codici a barre unici e identificarli accuratamente, questa tecnica ha il potenziale per importanti progressi nella ricerca biologia cellulare. I ricercatori possono utilizzare questo metodo per varie applicazioni, tra cui screening genetico e tracciamento di linee cellulari, portando infine a una comprensione più profonda dei meccanismi cellulari.

#Procedure generali sperimentali

Per creare la libreria di codici a barre MuSIC, i ricercatori hanno utilizzato varie tecniche di biologia molecolare per costruire e convalidare i loro codici a barre. Hanno clonato proteine fluorescenti in specifici scheletri plasmidici, preparato cellule competenti e effettuato trasformazioni per garantire l'efficiente incorporazione dei codici a barre nelle cellule.

#Preparazione delle cellule competenti

I ricercatori hanno preparato cellule competenti per garantire un'alta efficienza di trasformazione. Hanno coltivato cellule di E. coli, seguite da una serie di lavaggi e risospensioni in soluzioni tampone ghiacciate. Questo processo ha massimizzato l'assorbimento del DNA nelle cellule batteriche durante la trasformazione.

#Procedura di trasformazione chimica

Il team ha introdotto i codici a barre nelle cellule di E. coli tramite un processo di trasformazione chimica. Utilizzando specifici trattamenti termici e mezzi di crescita, sono riusciti a trasformare con successo le cellule e a far esprimere i codici a barre MuSIC per ulteriori analisi.

#Screening e validazione

Dopo la trasformazione, i ricercatori hanno eseguito uno screening delle colonie per verificare l'integrazione riuscita dei codici a barre MuSIC. Hanno effettuato PCR su colonia per verificare la presenza dei costrutti desiderati, seguita da sequenziamento per confermare che il codice a barre corretto fosse presente.

#Sequenziamento a nanopore

Per analizzare le sequenze dei codici a barre, i ricercatori hanno utilizzato la tecnologia di sequenziamento a nanopore. Questo metodo consente letture lunghe, che aiutano a determinare accuratamente le combinazioni specifiche di proteine fluorescenti in ciascun codice a barre senza le complicazioni delle tecniche tradizionali di PCR.

#Preparazione del campione per citometria a flusso

Per le procedure di coltura cellulare e trasfezione, le cellule HEK293 sono state mantenute in condizioni adeguate per favorire una crescita sana. Le cellule sono state quindi trasfettate con i codici a barre MuSIC preparati e successivamente analizzate tramite citometria a flusso.

#Analisi dei dati

I dati della citometria a flusso sono stati elaborati meticolosamente per identificare i diversi codici a barre presenti nei campioni. I ricercatori hanno impiegato vari metodi statistici per interpretare i risultati e convalidare le loro scoperte rispetto ai risultati attesi.

#Riflettendo sui risultati

La generazione e l'identificazione riuscita dei codici a barre MuSIC dimostrano un significativo avanzamento negli strumenti disponibili per il tracciamento cellulare e l'analisi genica. Questo studio evidenzia l'utilità di combinare approcci per superare le limitazioni esistenti nel campo della ricerca cellulare.

#Pensieri finali

Con il progredire di quest'area di ricerca, le implicazioni di questi risultati porteranno probabilmente a modi più efficienti e completi per studiare le funzioni e le interazioni cellulari. Le indagini future si concentreranno sull'espansione della libreria di codici a barre disponibili e sul miglioramento dei metodi di rilevamento, aprendo la strada a nuove scoperte nelle scienze biologiche.