Analyse de l'émission de lumière dans les systèmes de microscopie

#Modèle de Microscope et Calculs de PSF

Dans cette section, on décrit un système de microscope utilisé pour analyser la lumière émise par un émetteur dipolaire et comment elle interagit avec une nanoparticule. Le système est installé dans de l'eau, placé au-dessus d'une lamelle en verre, avec une goutte d'huile entre la lamelle et l'objectif du microscope.

#a. Système de Microscope

Le système de microscope est conçu pour calculer la fonction de diffusion de points (PSF). La nanoparticule et l'émetteur dipolaire sont situés juste au-dessus de la lamelle en verre dans l'eau. Les composants optiques focalisent la lumière sur une caméra et sont traités comme une seule lentille dans ce modèle.

#b. Approche Numérique

Pour calculer la PSF, on suit trois étapes :

1. D'abord, on calcule les champs électromagnétiques (EM) dans la partie supérieure de l'installation (eau, verre et huile) en utilisant une méthode connue sous le nom de calculs en domaine temporel par différences finies (FDTD), qui utilise des logiciels spécialisés. Le verre et l'huile sont traités comme un seul milieu en raison de leur indice de réfraction similaire.
2. Ensuite, on projette ces champs sur un hémisphère de champ lointain pour visualiser la lumière à un mètre de la nanoparticule. Cela se fait en utilisant des fonctions intégrées dans le logiciel.
3. Dans la dernière étape, on concentre ces champs sur le plan de la caméra pour former la PSF.

#c. Approche Analytique

La méthode analytique comprend six étapes :

1. On calcule les champs EM dans l'eau en représentant l'émission dipolaire à l'aide d'une combinaison d'harmoniques sphériques vectorielles.
2. Puis, on applique la théorie de la Diffusion de Mie pour déterminer comment la lumière émise est dispersée par la nanoparticule sphérique.
3. Les champs sont tournés pour tenir compte de la position de l'émetteur dipolaire par rapport à la nanoparticule.
4. Les champs combinés sont décomposés en ondes planes.
5. On réfracte les ondes planes à l'interface eau-verre.
6. Enfin, les champs sont projetés dans le champ lointain et concentrés sur la caméra.

#Diffusion Multiple

Dans notre analyse, on peut ignorer la diffusion multiple de la nanoparticule. On décompose les champs dipolaires et diffusés en ondes planes et on regarde seulement les ondes qui entrent dans la lamelle en verre.

#a. Utilisation des PSFS Analytiques et Numériques

On compare les PSFs calculés sans contributions de réflexion avec ceux qui les incluent. Les plus grandes différences d'intensité sont faibles, ce qui nous amène à conclure que la complexité ajoutée par les réflexions n'est pas nécessaire pour notre modèle final.

#Théorie de Mie et Temps de Calcul

On peut tronquer les ordres infinis de Mie sans affecter significativement la PSF. L'analyse montre qu'un nombre limité d'ordres est nécessaire pour bien décrire les champs.

#a. Troncature des Ordres de Mie

Pour voir comment la troncature affecte les résultats, on teste différentes configurations de dipoles sur nanoparticules et mesure les différences dans le champ électrique à mesure que les ordres de Mie augmentent.

#b. Temps de Calcul

Le temps nécessaire pour calculer la PSF dépend de trois facteurs : le nombre de pixels dans la PSF, combien d'ordres de Mie sont considérés, et le nombre d'angles utilisés dans les calculs.

#Détermination des Paramètres Numériques

Lorsqu'on exécute des simulations FDTD, on définit la taille du domaine et la taille de la maille à des valeurs spécifiques pour garantir des résultats de PSF précis sans temps de calcul excessif.

#a. Taille de Simulation et Taille de Maille

On effectue plusieurs simulations en changeant la largeur du domaine et on trouve qu'une taille plus large donne des résultats plus précis. Une maille plus fine améliore aussi la précision mais augmente le temps de calcul nécessaire.

#Comparaison Complète des PSFs

On compare les champs lointains électriques et les PSFs des approches analytiques et numériques pour différentes configurations de nanoparticules. Cela nous aide à voir que dans la plupart des cas, les résultats des deux méthodes sont presque identiques.

#Bibliothèque de PSFs Distordues

On présente une collection de PSFs obtenues à partir d'une seule nanoparticule pendant une mesure de 30 minutes. Les PSFs montrent des caractéristiques distinctes et sont organisées chronologiquement.

#Événements de Liaison de l'ADN

Pour confirmer que la liaison de l'ADN est spécifique, on réalise des expériences de contrôle avec des séquences non complémentaires. En observant l'absence d'événements de liaison, on affirme que les événements observés proviennent d'interactions spécifiques.

#PSFs de Formes Exotiques

Lorsqu'on effectue de l'ADN-PAINT sur du verre sans nanoparticules, on ne voit que des PSFs de forme gaussienne. Cela montre que les formes uniques notées plus tôt sont dues à la présence des nanoparticules.

#Analyse de Données

On détaille comment les PSFs sont extraites des données brutes et comment les signaux de fond sont éliminés pour isoler les signaux de Fluorescence pertinents.

#a. Exemple de Trace Temporelle

Un exemple de trace temporelle illustre comment on identifie et regroupe les images consécutives pour représenter efficacement les événements de liaison.

#b. Soustraction de Fond

Pour chaque événement, on isole le signal fluorescent du bruit de fond, permettant une analyse précise des événements de liaison.

#Amélioration de la Fluorescence

En plaçant des fluorophores sur des nanoparticules, on voit un signal augmenté grâce au couplage plasmonique. On analyse les différences d'intensité entre les PSFs collectées sur des nanoparticules et celles qui ne le sont pas.

#Détermination Globale de la Position des NP

On décrit une méthode pour trouver la position de la nanoparticule, en l'affinant en fonction de la dérive au fil du temps. Cela garantit la mesure précise de chaque PSF émise.

#Résolution de l'Ambiguïté de la Forme de PSF

On aborde l'ambiguïté potentielle dans les formes de PSF causée par plusieurs positions d'émetteurs. En fixant la position de la nanoparticule pendant l'analyse, on distingue avec précision entre différentes configurations.

#Caractérisation Expérimentale des Nanoparticules

Pour confirmer les caractéristiques des nanoparticules d'or, on utilise diverses techniques d'imagerie pour s'assurer qu'elles correspondent aux tailles et formes attendues.

#PSFs de Groupes de NPs d'Or

On présente des exemples de PSFs résultant de groupes de nanoparticules, montrant des caractéristiques distinctes dans leur forme et leur intensité.

#Incertitude de Localisation

On analyse comment l'incertitude de localisation des fluorophores change en fonction de leur position sur la surface de la nanoparticule.

#qPAINT pour le Comptage des Brins de Docking

En utilisant le PAINT quantitatif, on détermine le nombre de brins de docking disponibles sur les surfaces des nanoparticules en analysant les statistiques de liaison.

#PSF d'Émetteurs Dipolaires Librement Rotatifs

On démontre que l'échantillonnage des PSFs d'un dipôle rotatif libre peut être représenté par la moyenne des PSFs de trois orientations fixes.

#Effet de la Taille de NP et du Paramètre de Flou

En examinant comment les paramètres fixes impactent la localisation, on conclut que certaines variations mineures n'altèrent pas significativement les résultats globaux.

#Autres Considérations pour l'Orientation des Fluorophores

On étudie comment différentes orientations des fluorophores près d'une nanoparticule affectent les formes de PSF détectées.

#Caractérisation des Aberrations

On explore comment les aberrations sphériques et elliptiques peuvent être caractérisées et corrigées dans nos mesures.

#Ajustement de PSF des Cadres Individuels

On analyse si l'ajustement des PSFs à partir de cadres individuels d'événements de liaison affecte les résultats de localisation, et on conclut que cela ne le fait pas.

#Collection d'Explications Visuelles

On offre des explications visuelles sur divers sujets liés à nos méthodes et découvertes, assurant la clarté de nos processus analytiques.

#Détermination des Paramètres Analytiques

Les paramètres utilisés pour la modélisation analytique sont systématiquement définis pour garantir une cohérence tout au long de notre analyse.

#Conclusion

Ces informations supplémentaires offrent un aperçu détaillé des méthodologies, des résultats et des implications de notre travail sur les PSFs, les nanoparticules et les phénomènes associés en microscopie. Elles servent de ressource complète pour comprendre les processus impliqués dans l'analyse de la lumière émise par des émetteurs dipolaires proches des nanoparticules, leurs comportements de diffusion et les implications résultantes pour la recherche future.