Fortschritte bei den Techniken zur Proteinidentifikation

Jüngste Verbesserungen in der Massenspektrometrie haben es möglich gemacht, über 10.000 Proteine in gängigen menschlichen Zellproben auf einen Schlag zu identifizieren. Das ist ein grosser Schritt, weil typische menschliche Zellen etwa 12.000 Arten von mRNA enthalten. Das Ziel ist es, so viele Proteine wie möglich in einer einzigen Analyse zu erfassen.

Eine bemerkenswerte Studie hat ein Massenspektrometer verwendet, um etwa 12.000 Proteine aus bestimmten menschlichen Zellen, die als HEK293T-Zellen bekannt sind, zu identifizieren. Viele dieser Proteine sind wichtig für die Zellkommunikation, was sie für die Forschung wertvoll macht. Daher ist es sehr wichtig, niedrig exprimierte Proteine auf einfache Weise zu beobachten.

Heute wird erwartet, dass zwei fortgeschrittene Massenspektrometer in einer einzigen Analyse mehr als 12.000 Proteine identifizieren. Eines dieser Geräte ist bekannt für seine hohe Geschwindigkeit, Auflösung und Empfindlichkeit. Das hilft Wissenschaftlern, ein breites Spektrum an Proteinen zu erfassen. Das andere Gerät konzentriert sich darauf, Ionen zu sortieren und die Analysetiefe mit neuen Technologien zu verbessern.

Darüber hinaus werden neue Methoden erforscht, die die Proteinanalysen weiter verbessern können. Allerdings gibt es bisher nicht viele Berichte darüber, wie gut diese Methoden bei der Analyse tiefgreifender Proteome mit den neueren Geräten abschneiden.

#Bedeutung der Flüssigchromatographie

Die Art und Weise, wie die Flüssigchromatographie (LC) eingerichtet ist, spielt eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung der Proteinidentifizierung. Bessere Chromatographie hilft, die Komplexität der Proben zu reduzieren, sodass mehr Peptide nachgewiesen werden können. Eine einfache Methode zur Verbesserung besteht darin, längere Säulen mit kleinen Partikeln zu verwenden. Auch wenn das den Druck erhöhen kann, ist es ein wichtiger Faktor zur Verbesserung der Proteinidentifikation.

In dieser Forschung war das Ziel, über die Erkennung von 12.000 Proteinen mit einer bestimmten Art der Massenspektrometrie hinauszugehen, die noch nicht gründlich untersucht wurde. Die Forscher haben zuerst untersucht, wie man die Parameter für tiefere Proteomik optimieren kann, und eine neue Methode entwickelt, die sich auf die wichtigsten Bereiche für die Detektion konzentriert.

Als Nächstes wurde eine lange Chromatographiesäule verwendet, um fast 12.000 einzigartige Proteine aus menschlichen Zellproben erfolgreich nachzuweisen. Zudem wurden Blutplasma und Serum mit einer speziellen Anreicherungsmethode analysiert, die ebenfalls Tausende von einzigartigen Proteinen identifizierte.

#Experimentelle Verfahren

#Zellkultur und Proteinentnahme

HEK293T-Zellen wurden unter bestimmten Bedingungen gezüchtet und später zur Analyse abgetrennt. Nach dem Waschen wurden diese Zellen eingefroren, bis sie weiterverwendet wurden. Die Proteine aus diesen Zellen wurden mit einem speziellen Puffer extrahiert und dann verarbeitet, um ihre Konzentration zu bestimmen.

#Vorbereitung von Plasma und Serum

Serum- und Plasmaproben wurden mit einer einzigartigen Methode behandelt, um Proteine mit niedriger Abundanz anzureichern. Diese Behandlung beinhaltete das Hinzufügen spezieller Partikel, die die Proteine erfassen konnten, gefolgt von Waschen und Extrahieren zur Analyse. Die Methode wurde zur Verbesserung der Effizienz automatisiert.

#Proteolyse

Die Proteinproben durchliefen einen Reinigungs- und Verdauungsprozess mit einer speziellen Technik. Dabei wurde das Protein mit speziellen magnetischen Partikeln gemischt, die halfen, es zu isolieren, bevor es in kleinere Stücke für eine einfachere Analyse verdaut wurde.

#Analyse durch Nano LC-MS/MS

Die kleineren Proteinstücke wurden in ein System injiziert, wo sie mit zwei Arten von Chromatographiesäulen getrennt wurden. Die Proteine wurden dann mit Massenspektrometrie analysiert, bei der Daten über ihre Masse und Ladung gesammelt wurden, um verschiedene in den Proben vorhandene Proteine zu identifizieren.

#Vergleich verschiedener Techniken

Es wurde ein Vergleich zwischen zwei verschiedenen Methoden zur Proteinanalytik angestellt. Eine Methode zielte auf ein breites Spektrum detektierter Ionen ab, während die andere sich auf enge Bereiche konzentrierte, wo Proteine wahrscheinlicher vorhanden waren. Die zweite Methode führte zu einer höheren Identifizierung von Proteinen und Vorläufern und erwies sich als effektiver.

#Nutzung langer Chromatographiesäulen

Das Forschungsteam setzte eine lange Chromatographiesäule ein, um eine tiefere Analyse zu erreichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Verwendung längerer Säulen die Anzahl der in den Proben identifizierten Proteine verbesserte. Eine spezifische Lade Menge wurde als optimal für die besten Ergebnisse ermittelt.

Bei der Messung derselben Proben mehrmals wurde eine hohe Reproduzierbarkeit erreicht, was die Zuverlässigkeit der verwendeten Methoden bestätigte. Die durchschnittliche Anzahl identifizierter Proteine in den verschiedenen Zelltypen war beeindruckend und bestätigte die hohe Leistungsfähigkeit dieses Systems zur tiefen Proteomanalyse.

#Tiefe Analyse des Plasma- und Serumproteoms

Die verbesserten Methoden wurden dann angewendet, um Plasma- und Serumproben zu analysieren. Es wurden zwei verschiedene Vorbehandlungsmethoden verwendet, und die Ergebnisse zeigten, dass eine Methode die andere bei der Identifizierung von Proteinen übertraf. Tatsächlich entdeckte die sensitivere Methode mehr als doppelt so viele Proteine im Vergleich zur anderen.

Interessanterweise wurden mit der sensitiven Methode in Plasma deutlich mehr Proteine gefunden als im Serum, was ihre Effektivität beim Erfassen von Spurproteinen zeigt. Frühere Studien hatten angezeigt, dass ein anderer Ansatz am besten geeignet sei, um diese Proteine anzureichern, aber die neue Methode ergab bessere Ergebnisse.

In einer Analyse wurden etwa 8.500 Plasma-Proteine identifiziert. Der Vergleich der beiden verschiedenen Methoden zeigte einen signifikanten Vorteil für den neuen Ansatz, insbesondere bei der Identifizierung spezifischer Proteine, die mit von der FDA zugelassenen Medikamenten verbunden sind.

Aktuelle Methoden zur Plasma- und Serumanalyse konzentrieren sich oft mehr auf die Anzahl der verarbeiteten Proben als auf die Analysetiefe. Bei bestimmten Krankheiten, insbesondere bei seltenen, ist es entscheidend, tiefere Analysen durchzuführen, um wertvolle Informationen für die Forschung zu sammeln.

#Fazit

Die Entwicklung einer neuen Methode, die sich nur auf bestimmte Proteinbereiche konzentriert, hat es den Forschern ermöglicht, 12.000 Proteine aus typischen menschlichen Zellen in einer einzigen Analyse zu identifizieren. Die Verwendung langer Chromatographiesäulen hat die Identifizierung von Proteinen weiter verbessert. Das kombinierte System erwies sich als erfolgreich bei der Analyse von Blutproben und lieferte Tausende von einzigartigen Proteinen in einer einzigen Analyse.

Diese Forschung stellt einen bedeutenden Fortschritt im Bereich der Proteomik dar und bietet Werkzeuge, die entscheidend sein können, um neue Biomarker zu entdecken und verschiedene Krankheiten besser zu verstehen. Indem der Fokus auf Tiefe statt nur auf Geschwindigkeit gelegt wurde, bietet die Forschung einen wertvollen Ansatz für zukünftige Studien in der Proteomik.