Neue Erkenntnisse zur m6Am-Modifikation in mRNA

Modifizierte Nucleotide spielen eine entscheidende Rolle bei der Funktion von mRNA, dem Molekül, das genetische Informationen zum Herstellen von Proteinen in Zellen trägt. Eines der häufigsten modifizierten Nucleotide in mRNA heisst m6Am (N6,2'-O-dimethyladenosin). Diese spezielle Modifikation findet sich ganz am Anfang der mRNA, dem sogenannten Transkriptionsstartnucleotid (TSN). Der TSN entspricht einer Position in der DNA, wo die Transkription anfängt.

Wenn ein Gen in mRNA transkribiert wird, erhält der TSN normalerweise eine Modifikation namens 2'-O-Methylmodifikation. Diese Veränderung wird von einem Enzym namens CMTR1 hinzugefügt. Wenn der TSN ein Adenosin ist, kann eine zusätzliche Modifikation auftreten, wenn ein weiteres Enzym namens PCIF1 eine Methylgruppe hinzufügt, was zu m6Am führt.

Forschung hat gezeigt, dass m6Am wichtig für die Funktionsweise von Zellen ist. Zum Beispiel scheinen normale Zellen nicht langsamer zu wachsen, wenn sie kein PCIF1 haben. Allerdings kann ein Mangel an PCIF1 unter oxidativem Stress das Zellwachstum behindern. In Krebszellen, besonders während bestimmter Behandlungen, kann das Fehlen von PCIF1 zu höheren Zellsterberaten führen. Ausserdem kann ein Mangel an PCIF1 bei Virusinfektionen die HIV-Replikation steigern und auch andere Viren beeinflussen.

Angesichts der Bedeutung von m6Am haben Wissenschaftler versucht, mRNAs zu identifizieren und zu untersuchen, die diese Modifikation enthalten. Erste Studien haben gezeigt, dass mRNAs entweder in einer m6Am-Form oder in einer nicht-modifizierten Form namens Am (2'-O-Methyladenosin) existieren können, wobei Am häufiger vorkommt. Um m6Am-modifizierte Gene zu identifizieren, wurden über die Jahre verschiedene Methoden entwickelt. Dennoch bleibt der genaue Einfluss von m6Am auf mRNA trotz zahlreicher Studien, die diese Modifikationen über verschiedene Transkripte kartieren, unklar.

#Die Herausforderung beim Verständnis von m6Am

Eine der Hauptschwierigkeiten beim Verständnis von m6Am hängt damit zusammen, wie Gene charakterisiert wurden. Frühere Kartierungsstudien behandelten m6Am so, als ob es wie andere modifizierte Nucleotide innerhalb der mRNA funktioniert. m6Am, das ganz am Anfang des Transkripts sitzt, wird jedoch durch die verschiedenen Möglichkeiten, wie ein Gen exprimiert werden kann, beeinflusst, was zu verschiedenen Transkript-Isoformen führt, die an unterschiedlichen Punkten beginnen. Das bedeutet, dass viele Gene kein einzelnes Startnucleotid haben, was es schwierig macht, einen spezifischen Modifikationsstatus basierend auf früheren Studien zuzuordnen.

Ausserdem wurden diese Studien so kategorisiert, dass jedes Gen entweder m6Am oder nicht hat. Diese binäre Klassifizierung berücksichtigt nicht die Möglichkeit, dass einige Transkripte unterschiedliche Mengen an m6Am aufweisen, wobei einige m6Am enthalten und andere Am. Dieser Mangel an Nuancen kann zu falschen Schlussfolgerungen über die Rolle von m6Am führen.

Es ist auch erwähnenswert, dass m6Am in kleinen nukleären RNAs (snRNAs) verbreitet ist, die am Prozess des Spleissens beteiligt sind. Zunächst dachte man, dass die meisten snRNAs mit Am beginnen. Spätere Studien zeigten jedoch, dass eine signifikante Anzahl dieser snRNAs ebenfalls m6Am enthält, das anschliessend von einem anderen Enzym namens FTO demethyliert wird.

#CROWN-seq: Eine neue Methode zur Kartierung von m6Am

Um die Verteilung und den Einfluss von m6Am besser zu verstehen, entwickelten Forscher eine neue Methode namens CROWN-seq. Diese Technik ermöglicht es Wissenschaftlern, die TSNs aller 5'-Transkript-Isoformen genau zu kartieren und die Mengen von m6Am an diesen Stellen zu quantifizieren.

CROWN-seq ist einzigartig, weil es die Signale von den TSNs anreichert, indem es die Enden der mRNA selektiv analysiert. Während CROWN-seq wandelt eine chemische Behandlung Am in eine andere Form um, sodass Forscher bestimmen können, ob der TSN als m6Am modifiziert ist oder als Am bleibt. Dies geschieht, indem die m7G-besetzten Transkripte getrennt und die Mengen von m6Am an jedem Startpunkt in verschiedenen Zelltypen quantifiziert werden.

Die Ergebnisse von CROWN-seq haben eine signifikante Vielfalt an TSNs unter den Genen gezeigt und demonstriert, dass viele Gene nicht genau durch ein einzelnes Transkriptionsstartnucleotid charakterisiert werden können. Die Forschung zeigte, dass fast alle A-initiierte Transkript-Isoformen eine hohe m6Am-Stoichiometrie aufweisen, was bedeutet, dass m6Am die vorherrschende Form zu Beginn der Transkription in diesen Fällen ist.

#Ergebnisse zur Verteilung und den Levels von m6Am

Die CROWN-seq-Methode identifizierte insgesamt 219.195 TSNs, von denen 92.278 als A-TSNs in mehreren menschlichen Zelllinien identifiziert wurden. Diese umfassende Kartierung zeigt die hohe Verbreitung von m6Am in mRNA, im Gegensatz zu früheren Annahmen, die auf weniger genauen Methoden basierten.

Die Daten deuten darauf hin, dass m6Am weitgehend mit höheren Levels der Genexpression assoziiert ist, wobei Transkripte, die mit m6Am beginnen, häufiger erscheinen als zuvor erkannt. Die Auswirkungen variierender m6Am-Levels waren bemerkenswert unterschiedlich über verschiedene Transkriptionsmechanismen hinweg. Insbesondere korrelierten bestimmte Motive in den Promotorregionen von Genen mit den m6Am-Levels, was darauf hindeutet, dass die Anwesenheit von m6Am die Transkription verstärken könnte.

#Die Beziehung zwischen m6Am und Transkription

Eine der interessanten Erkenntnisse aus der Forschung ist die direkte Verbindung zwischen m6Am und transkriptioneller Aktivität. Höhere m6Am-Stoichiometrie in Transkripten war generell mit erhöhten Levels der Genexpression verknüpft. Diese Beziehung wirft Fragen darüber auf, ob m6Am als stabilisierender Faktor in mRNAs wirkt oder ob es eine besondere Rolle im Prozess der Transkriptionsinitiation hat.

Die Studie fand heraus, dass A-TSNs mit höheren m6Am-Levels einen signifikanten Rückgang der Expression erlebten, als das Enzym PCIF1 ausgeschaltet wurde. Im Gegensatz dazu zeigten A-TSNs mit niedrigeren m6Am-Levels minimale Veränderungen in der Expression. Dies deutet auf eine potenzielle Abhängigkeit von m6Am für Transkriptionsmechanismen hin, die spezifische Promotormotive aktivieren.

#Beobachtungen in verschiedenen Zelltypen

Die Forscher untersuchten auch die m6Am-Stoichiometrie in neun verschiedenen Zelllinien und beobachteten hohe Levels in allen. Während die PCIF1-Expression mit den m6Am-Levels bis zu einem gewissen Grad korrelierte, zeigten selbst Zelllinien mit niedriger PCIF1-Expression immer noch hohe m6Am-Stoichiometrie. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass Faktoren ausserhalb von PCIF1 zur Regulierung von m6Am in mRNA beitragen könnten.

Neben mRNAs quantifizierte CROWN-seq auch die m6Am-Level in snRNA und snoRNA. Interessanterweise zeigten die Ergebnisse, dass snRNAs ein anderes Profil von m6Am-Modifikationen hatten, mit allgemein niedrigeren Levels und mehr Variabilität über verschiedene Zelllinien im Vergleich zu mRNA.

#Die Rolle von FTO bei der Regulierung von m6Am

Die Ergebnisse heben die Rolle von FTO hervor, einem Enzym, das m6Am demethyliert, bei der Kontrolle der m6Am-Levels in snRNAs und snoRNAs. Die Forschung zeigte, dass die FTO-Expression negativ mit den m6Am-Levels korrelierte, was bedeutet, dass höhere FTO-Levels zu niedrigeren m6Am führten. Als FTO ausgeschaltet wurde, stiegen die m6Am-Levels in snRNAs signifikant, was zeigt, dass FTO ein wichtiger Regulator ist.

Während FTO eine kritische Rolle in snRNA spielt, war sein Einfluss auf m6Am in mRNA minimal, was darauf hindeutet, dass m6Am möglicherweise durch unterschiedliche Mechanismen in diesen beiden RNA-Typen reguliert wird.

#Fazit: Eine neue Perspektive auf m6Am in mRNA

Die Einführung von CROWN-seq hat einen klareren Blick auf die m6Am-Landschaft in mRNA ermöglicht. Frühere Studien stützten sich stark auf die Idee, dass Gene durch ein einzelnes TSN dargestellt werden könnten, was zu potenziellen Ungenauigkeiten bei der Kartierung von m6Am führte. CROWN-seq löst diese Probleme, indem es alle Startstellen kartiert und die Levels von m6Am quantitativ misst.

Die Forschung unterstreicht die Bedeutung von m6Am bei der Transkriptionsinitiation anstelle von Stabilität. Die Korrelation zwischen m6Am und einer erhöhten Transkriptabundanz deutet darauf hin, dass es spezifische regulatorische Rollen im Zusammenhang mit Transkriptionsmechanismen geben könnte, die durch die Kern-Promotorsequenz geleitet werden.

In Zukunft sind further Studien nötig, um die Funktionen von m6Am und seine Interaktionen mit verschiedenen zellulären Wegen vollständig zu erkunden, einschliesslich wie es die Funktionen von snRNA und snoRNA beeinflussen könnte. Die Beziehung zwischen m6Am und der Transkriptionsinitiation könnte tiefgreifende Auswirkungen auf unser Verständnis der Genregulation und -expression in allen Zellen haben.