Avanços na pesquisa sobre enzimas P450

As Enzimas citocromo P450, conhecidas como P450s, estão presentes em muitos organismos eucarióticos, incluindo plantas, animais e fungos. Essas enzimas têm papéis essenciais na degradação de uma ampla gama de substâncias, tanto as produzidas pelo corpo (endógenas) quanto as que vêm de fontes externas (exógenas). Os P450s são proteínas especiais que ajudam no processo de oxidação, que é uma reação química que adiciona oxigênio a uma molécula. A maioria dos P450s fica ligada a membranas dentro das células, especialmente em uma estrutura chamada retículo endoplasmático (RE), onde interagem com substâncias químicas e realizam suas funções.

Para funcionarem bem, as enzimas P450 precisam de moléculas auxiliares chamadas cofatores, que geralmente são formas de NADH ou NADPH. Outra proteína importante, chamada citocromo P450 redutase (CPR), ajuda a transferir os agentes redutores necessários do NADPH para as enzimas P450.

#Desafios no Estudo dos P450s

Estudar os P450s pode ser bem complicado por vários motivos. Primeiro, existem muitos tipos diferentes de enzimas P450 em cada organismo. Por exemplo, os camundongos têm cerca de 102 tipos, enquanto a planta comum Arabidopsis thaliana tem cerca de 244 tipos. Em segundo lugar, a atividade dessas enzimas depende muito da presença de redutores gerados pelos CPRs. Terceiro, como os P450s estão localizados dentro das membranas celulares, os pesquisadores frequentemente precisam isolar frações de membrana inteiras para estudá-los, o que complica a análise. Por último, para muitas enzimas P450, não há substratos ou inibidores específicos conhecidos disponíveis para estudo, dificultando a análise de sua atividade.

Para superar esses desafios, novas técnicas são necessárias para estudar e entender melhor os P450s. Uma técnica promissora é a profilagem proteica baseada em atividade (ABPP). Esse método usa sondas químicas que se ligam a enzimas ativas, permitindo que os pesquisadores as identifiquem e estudem em detalhes. As sondas podem reagir com as enzimas de uma maneira que depende de sua atividade, o que ajuda a distinguir as formas ativas das inativas.

#Usando Sondas Químicas para Estudar P450s

Pesquisadores já usaram sondas químicas para estudar P450s específicos em vários organismos, incluindo mamíferos, insetos e bactérias. Essas sondas atuam como moléculas substrato que as enzimas P450 normalmente processariam. Ao passarem por uma reação química com os P450s, elas se tornam reativas e podem se ligar a locais específicos dentro da enzima. Por meio desse método, os pesquisadores podem rotular e rastrear formas ativas de P450s em diferentes organismos.

Neste estudo, os pesquisadores utilizaram essas sondas químicas para identificar P450s ativos em plantas e fungos. Eles queriam entender melhor como essas enzimas contribuem para vias metabólicas e como funcionam dentro de seus respectivos organismos.

#Investigando ZmCYP81A9 no Milho

Um P450 específico, ZmCYP81A9 de Zea mays (milho), foi estudado devido ao seu papel na degradação de Herbicidas. Essa enzima pode modificar vários herbicidas, tornando-se um alvo importante para entender o metabolismo das plantas e a resistência aos herbicidas. Para analisar ZmCYP81A9, os pesquisadores a expressaram na levedura de cerveja para simplificar a análise.

Por meio de ensaios de atividade, descobriram que o ZmCYP81A9 podia converter um herbicida chamado bentazon em uma forma diferente, indicando seu papel ativo no metabolismo. Eles também testaram várias sondas P450 e descobriram que essas sondas inibiam consistentemente a atividade do ZmCYP81A9, confirmando sua eficácia para estudar essa enzima.

#Expressão Transitória de ZmCYP81A9 em Plantas

Após confirmar a atividade do ZmCYP81A9 na levedura, os pesquisadores se voltaram para as plantas. Eles expressaram ZmCYP81A9 com uma tag de proteína fluorescente verde (GFP) nas folhas de Nicotiana Benthamiana usando um método chamado agroinfiltração. Esse método permite uma expressão rápida e eficiente de proteínas nas células das plantas. Ao rotular a enzima com GFP, os pesquisadores puderam verificar facilmente sua presença e localização dentro das células das plantas.

Usando microscopia confocal, os pesquisadores determinaram que o ZmCYP81A9 estava localizado no RE, onde se espera que funcione. A presença do ZmCYP81A9 foi confirmada por meio de técnicas de imagem que mostraram sua forte correlação com marcadores do RE.

#Rotulando ZmCYP81A9 com Sondas

Em seguida, os pesquisadores isolaram microsomos das células vegetais que expressavam ZmCYP81A9-GFP para testar o rotulamento com diferentes sondas P450. Eles descobriram que os sinais fluorescentes indicavam um rotulamento bem-sucedido do ZmCYP81A9 com certas sondas, provando que a enzima estava ativa e reagindo com as sondas como esperado.

No entanto, eles também notaram sinais de fundo que complicaram os resultados. Esse fundo foi principalmente devido a uma proteína vegetal abundante chamada ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase (RBCL), que aparecia em um peso molecular semelhante ao dos P450s. Rotular o ZmCYP81A9 com GFP efetivamente alterou seu peso molecular, facilitando a detecção sem interferência da RBCL.

#Confirmação do Rotulamento de P450 através de Proteômica

Para confirmar o rotulamento do ZmCYP81A9, os pesquisadores realizaram análises proteômicas adicionais. Usando espectrometria de massa, eles coletaram dados de proteínas isoladas que haviam sido rotuladas com as sondas P450. Os resultados mostraram o ZmCYP81A9 como um destaque proeminente, confirmando seu rotulamento por duas sondas específicas.

Curiosamente, eles também identificaram vários outros P450s endógenos em Nicotiana benthamiana que foram rotulados com as sondas. Isso indicou que as sondas P450 poderiam rotular efetivamente não só o ZmCYP81A9 introduzido, mas também outros P450s ativos presentes na planta.

#Profilagem de P450 no Fígado de Camundongo

Os pesquisadores então mudaram seu foco para microsomos do fígado de camundongo, uma rica fonte de enzimas P450. Eles rotularam esses microsomos com as sondas P450 para avaliar sua eficácia. O rotulamento mostrou altos níveis de atividade entre vários P450s de camundongo, destacando a utilidade desse método na profilagem de P450s em diferentes espécies.

Eles descobriram que certas sondas levavam aos sinais fluorescentes mais substanciais, confirmando que vários P450s de camundongo poderiam ser rotulados com sucesso usando sua abordagem. Essa informação é crucial para entender como essas enzimas ajudam a degradar diferentes substâncias no corpo, incluindo drogas e toxinas.

#Expressão de Cyp1a2 de Camundongo em Plantas

Para estender ainda mais seus estudos, os pesquisadores clonaram um P450 de camundongo, Cyp1a2, e o expressaram em N. benthamiana. Ao rotular Cyp1a2 com GFP, confirmaram sua localização no RE. Eles continuaram avaliando se a enzima estava ativa e poderia ser rotulada pelas sondas P450.

Os experimentos mostraram que a enzima de camundongo podia realmente ser rotulada com as sondas nas células vegetais, demonstrando que esse método poderia ser usado para investigar P450s de diferentes organismos em um sistema vegetal. Esse trabalho abre caminhos para novos estudos sobre a função dos P450s em vários contextos biológicos.

#Estudando P450s em Patógenos Fúngicos

Em seguida, os pesquisadores examinaram os P450s em Zymoseptoria tritici, um fungo que causa danos significativos às colheitas. Entender os P450s nesse patógeno é fundamental para abordar a resistência a fungicidas que são comuns nas práticas agrícolas. Usando as sondas P450, eles conseguiram rotular e identificar P450s ativos em Zymoseptoria tritici.

A análise revelou 13 P450s diferentes no fungo, com um, ZtCYP5078B1, sendo particularmente significativo. Esses dados podem ajudar a entender como o fungo desintoxica fungicidas e potencialmente leva à resistência.

#O Impacto da Reatividade das Sondas

Uma descoberta fascinante dessa pesquisa foi que diferentes P450s apresentam sensibilidade variável às sondas. Ao expressar vários P450s fúngicos em N. benthamiana, os pesquisadores descobriram que cada enzima tinha um perfil de reatividade único com as sondas. Isso indicou a necessidade de usar uma mistura de sondas para capturar uma variedade maior de atividade P450 em estudos futuros.

#Resumo dos Resultados

Resumindo, essa pesquisa demonstrou o uso bem-sucedido de sondas P450 para identificar enzimas ativas em diferentes organismos, incluindo plantas, animais e fungos. O uso da agroinfiltração para expressar versões marcadas dos P450s permitiu a identificação e análise rápida dessas enzimas em seus ambientes celulares nativos.

O trabalho destacou a importância dos P450s em processos metabólicos e de desintoxicação, fornecendo insights sobre como essas enzimas funcionam em vários sistemas biológicos. Os achados podem ajudar a desenvolver melhores estratégias para combater a resistência em patógenos agrícolas, além de entender o metabolismo de medicamentos e a desintoxicação em mamíferos.

#Conclusão

No geral, a combinação de técnicas avançadas e sondas químicas abre novas possibilidades para estudar enzimas P450. Essa pesquisa abre caminho para uma caracterização mais aprofundada dessas enzimas, que desempenham funções cruciais em muitos processos biológicos, desde mecanismos de defesa nas plantas até o metabolismo de drogas em humanos. À medida que nossa compreensão dos P450s se expande, também aumenta o potencial para desenvolver aplicações direcionadas em medicina e agricultura. A capacidade de estudar essas enzimas em diferentes sistemas destaca a versatilidade dos métodos empregados, tornando-os ferramentas valiosas para pesquisas futuras.