Novas Ideias sobre o Ciclo de Vida da Leishmania
Pesquisas ajudam a entender o ciclo celular da Leishmania usando técnicas de imagem avançadas.
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Índice
Leishmania são organismos minúsculos que podem causar doenças sérias em humanos e animais. Esses organismos podem levar a vários problemas de saúde, incluindo feridas na pele que podem deixar cicatrizes e condições internas mais graves que podem ser letais. Existem muitos tipos de Leishmania e elas se espalham por picadas de moscas específicas chamadas flebótomos.
Um dos aspectos mais importantes de como esses parasitas causam doenças é seu ciclo de vida. Para completar seu ciclo de vida e deixar as pessoas doentes, a Leishmania precisa se reproduzir dentro de seus hospedeiros. Portanto, os cientistas estão tentando entender melhor como funciona o ciclo de crescimento desses parasitas em um nível detalhado. Essas informações podem ajudar a encontrar novos tratamentos para doenças causadas por Leishmania.
A Estrutura da Leishmania
Leishmania faz parte de um grupo maior de organismos conhecido como Kinetoplastida. Uma das características únicas desses organismos é que eles têm duas estruturas celulares que contêm DNA: o núcleo e o kinetoplast. O kinetoplast está ligado a estruturas importantes que ajudam o parasita a se mover, chamadas flagelos. O flagelo sai de uma parte especial da célula chamada bolsa flagelar, que também é a área onde a célula absorve e libera materiais.
Além dessas estruturas, a Leishmania tem uma pequena parte celular chamada aparelho de Golgi, que ajuda no processamento e transporte de proteínas. A forma da célula e a disposição dessas estruturas mudam conforme a célula passa pelo seu ciclo. Compreender essas mudanças é essencial, já que estão ligadas à forma como a Leishmania se reproduz e se desenvolve.
O Ciclo Celular da Leishmania
O ciclo celular da Leishmania é dividido em várias fases. No começo do ciclo, conhecido como fase G1, a célula tem um núcleo, um kinetoplast e um flagelo. Enquanto a célula avança pela fase G1, ela cresce em comprimento. Quando a fase G1 termina, a célula entra na fase S, durante a qual duplica seu DNA. As mudanças na forma da célula durante essa fase são significativas.
Depois da fase S, a célula entra em uma fase G2 que se pensa ser muito curta. Em seguida, a célula passa pela mitose, onde se divide em duas novas células. Durante a mitose, as células podem mudar de forma novamente, ficando mais curtas e mais largas.
Estudos diferentes relataram sequências variadas sobre quando o núcleo e o kinetoplast se dividem. Alguns estudos sugerem que o núcleo geralmente se divide antes do kinetoplast, enquanto outros indicam o contrário. Técnicas de imagem recentes revelaram que, em alguns casos, a última conexão entre os núcleos filhas só é rompida após a divisão do kinetoplast.
Uma vez que o processo de divisão está completo, o último passo do ciclo celular é chamado de citocinese. É aqui que a célula se divide em duas células separadas. O processo envolve mudanças na estrutura do citoesqueleto, uma estrutura que ajuda a manter a forma da célula.
Mensurando o Ciclo Celular
Para entender como Leishmania avança por esse ciclo, os cientistas normalmente usam diferentes métodos para observar e medir as estruturas celulares. Eles podem usar técnicas de coloração especiais para destacar as estruturas dentro das células, junto com técnicas visuais para medir o tamanho das células. No entanto, esses métodos podem ser trabalhosos e vêm com desafios. Por exemplo, enquanto a microscopia pode oferecer imagens detalhadas, pode ser demorado, especialmente ao lidar com grandes populações de células.
Por outro lado, métodos de citometria de fluxo podem processar muitas células de uma vez, mas não conseguem fornecer imagens detalhadas ou informações sobre como as estruturas estão dispostas dentro das células. Assim, os pesquisadores têm procurado novas tecnologias para analisar melhor o ciclo celular da Leishmania.
Citometria de fluxo de imagem: Uma Nova Abordagem
A citometria de fluxo de imagem (IFC) representa um método promissor para analisar células. Essa tecnologia combina a capacidade de processamento rápido da citometria de fluxo com as capacidades de imagem detalhada da microscopia. Ela consegue tirar imagens de alta resolução de inúmeras células em pouco tempo. Isso significa que os pesquisadores podem coletar muitos dados e analisar várias propriedades de células individuais ao mesmo tempo.
A IFC permite que os cientistas capturem imagens em diferentes modos, o que ajuda a analisar várias características das células, como comprimento e largura. A tecnologia possibilita definir populações celulares específicas com base na morfologia e no conteúdo de DNA. Ela pode até classificar células em diferentes estágios do ciclo celular automaticamente.
Estudando o Ciclo Celular da Leishmania com Citometria de Fluxo de Imagem
Para ver se a IFC poderia ser útil no estudo do ciclo celular da Leishmania, os pesquisadores examinaram células vivas e células fixadas. Eles descobriram que, ao analisar imagens das células, era possível ver etapas distintas do ciclo celular e validar que as mudanças morfológicas dependentes do ciclo celular eram observáveis tanto em populações vivas quanto fixadas.
Notavelmente, ao usar corantes para o DNA, um corante específico, o Vybrant DyeCycle Orange (DCO), foi encontrado para manchar o DNA quantitativamente em células vivas. Isso permitiu que os pesquisadores monitorassem o conteúdo de DNA e estimassem o estágio do ciclo celular para células individuais de forma eficaz.
Resultados do Estudo
Usando IFC e DCO, os pesquisadores conseguiram distinguir diferentes estágios do ciclo celular na Leishmania. Eles foram capazes de diferenciar entre células no início e no final da fase G1, células na fase S e aquelas nas fases G2/M. Ao acompanhar a expressão e localização de uma proteína chamada KINF, marcada com um marcador fluorescente, também puderam ver quando mudanças específicas ocorreram durante o ciclo celular.
Isso levou à identificação do tempo para diferentes estágios do ciclo celular. Os pesquisadores descobriram que a fase G1 durava um tempo considerável, com a fase S sendo mais longa do que se pensava anteriormente, enquanto a fase G2 era relativamente curta.
Importância dos Resultados
Esses resultados representam um avanço significativo na compreensão do ciclo celular da Leishmania. A capacidade de categorizar células com base em sua morfologia e conteúdo de DNA fornece aos pesquisadores novas ferramentas para investigar como esses parasitas crescem e se dividem. Essas informações podem ser cruciais para desenvolver novos tratamentos contra doenças causadas por Leishmania.
As novas ferramentas e métodos demonstrados aqui poderiam ser aplicados não só à Leishmania, mas também para estudar outros parasitas e seus ciclos celulares.
Conclusão
O estudo da Leishmania e seu ciclo de vida é vital por causa das doenças que causam. Compreender seu ciclo celular pode revelar novos caminhos para soluções terapêuticas. A citometria de fluxo de imagem se mostrou um método eficaz para identificar e analisar os estágios do ciclo celular da Leishmania, o que pode ajudar a avançar significativamente a pesquisa nesse campo. Essa tecnologia oferece aos cientistas a chance de estudar a biologia desses parasitas em um nível sem precedentes, com potencial para descobertas impactantes nos próximos anos.
Título: Analysis of the Leishmania mexicana promastigote cell cycle using imaging flow cytometry provides new insights into cell cycle flexibility and events of short duration.
Resumo: Promastigote Leishmania mexicana have a complex cell division cycle characterised by the ordered replication of several single-copy organelles, a prolonged S phase and rapid G2 and cytokinesis phases, accompanied by cell cycle stage-associated morphological changes. Here we exploit these morphological changes to develop a high-throughput and semi-automated imaging flow cytometry (IFC) pipeline to analyse the cell cycle of L. mexicana in live cells. Firstly, we demonstrate that, unlike several other DNA stains, Vybrant DyeCycle Orange (DCO) is non-toxic and enables quantitative DNA imaging in live L. mexicana promastigotes. Secondly, by tagging the orphan spindle kinesin, KINF, with mNeonGreen, we describe KINFs cell cycle-dependent expression and localisation. Then, by combining manual gating of DCO DNA intensity profiles with automated masking and morphological measurements of parasite images, visual determination of the number of flagella per cell, and automated masking and analysis of mNG:KINF fluorescence, we provide a newly detailed description of L. mexicana promastigote cell cycle events that, for the first time, includes the durations of individual G2, mitosis and post-mitosis phases, and identifies G1 cells within the first 12 minutes of the new cell cycle. By applying IFC in this way, we were able, in minutes, to capture tens of thousands of high-quality brightfield and fluorescent images of live L. mexicana cells in solution, and to acquire quantitative data across multiple parameters for every image captured. Our custom-developed masking and gating scheme allowed us to identify elusive G2 cells and to demonstrate that the CDK-inhibitor, flavopiridol, arrests cells in G2 phase, rather than mitosis, providing proof-of-principle of the utility of IFC for drug mechanism-of-action studies. Further, the high-throughput nature of IFC allowed the close examination of promastigote cytokinesis, revealing considerable flexibility in both the timing of cytokinesis initiation and the direction of furrowing, in contrast to the related kinetoplastid parasite, Trypanosoma brucei. Significantly, our analysis demonstrate that the cleavage furrow can ingress unidirectionally from either pole of the cell, bidirectionally from both simultaneously or even commence internally along the anterior-posterior (A-P) axis. Our new pipeline offers many advantages over traditional methods of cell cycle analysis such as fluorescence microscopy and flow cytometry and paves the way for novel high-throughput analysis of Leishmania cell division. Author SummaryLeishmania mexicana is a single-celled parasite that is spread by sand flies and causes a spectrum of diseases called the leishmaniases in humans and animals. To cause disease, L. mexicana parasites must replicate and divide, and their cell division cycle has unusual and/or complex features, including that the parasite changes shape as it replicates. To aid analysis of the L. mexicana cell cycle, we developed a new quantitative DNA staining technique and also generated a fluorescent parasite cell line that highlighted when cells were dividing their DNA (mitosis) after replicating it. We then applied a high-throughput technique called imaging flow cytometry to capture images of tens of thousands of these parasites in just a few minutes. For each image, we were able to extract data about DNA replication, cell shape, whether the cells were in mitosis or not and how they divide. This provided new insights into how the parasites replicate and how long each stage of cell division takes as well as how the parasites split in two at the end of cell division. We were also able to use our analysis method to precisely determine the cell cycle stage at which a cell cycle inhibitor acts. More importantly, the imaging pipelines we have developed offer great advantages in terms of speed and depth over more traditional analysis techniques such as microscopy and should pave the way for increasingly detailed analyses of parasite cell biology in the future.
Autores: Tansy C Hammarton, J. Howell, S. Omwenga, M. Jimenez
Última atualização: 2024-04-16 00:00:00
Idioma: English
Fonte URL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.07.24.550259
Fonte PDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.07.24.550259.full.pdf
Licença: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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