Avanços na Marcação de Genes com o Sistema qTAG

A superexpressão de genes ajuda os cientistas a entenderem como os genes funcionam e como se relacionam com doenças. Mas, essa técnica tem suas desvantagens. Quando tem proteína demais, ela pode acabar no lugar errado da célula. Isso pode mudar a interação das proteínas, levando a consequências inesperadas. Por isso, é importante estudar as proteínas nas quantidades naturais. Assim, os pesquisadores podem entender melhor como uma proteína se comporta, onde vai e como interage com outras proteínas.

#Tecnologia CRISPR e Seu Impacto na Edição Genética

Desde 2012, a CRISPR revolucionou a biologia molecular. Essa ferramenta permite que os cientistas editem o DNA de forma precisa. Ela usa um RNA guia para direcionar as endonucleases Cas, como a Cas9, a locais específicos do genoma. Esse sistema é especialmente útil para anexar tags aos genes sem os riscos da superexpressão.

A Cas9 é bem precisa em encontrar as sequências de DNA corretas para cortar. Com a ajuda do RNA guia, a Cas9 pode identificar áreas específicas do DNA para fazer os cortes. Os processos naturais de reparo da célula entram em ação para consertar esses cortes. Se não tiver um molde para a reparação, a célula geralmente junta as extremidades quebradas em um processo chamado Junção de Extremidades Não Homólogas. Porém, isso pode levar a erros, como pequenas inserções ou deleções que atrapalham o gene.

Existem também outras formas de consertar que permitem edições mais precisas: reparo dirigido por homologia e junção mediada por microhomologia. O reparo dirigido por homologia precisa de um molde com sequências correspondentes para um reparo preciso. A junção mediada por microhomologia utiliza sequências correspondentes mais curtas. Embora esses métodos sejam mais precisos que a junção de extremidades não homólogas, são menos eficientes e podem demorar mais para serem ativados.

Por causa desses desafios, inserir sequências genéticas grandes frequentemente resulta em baixas taxas de sucesso. Os pesquisadores têm dificuldades em isolar células com as mudanças desejadas.

#Melhorando a Eficiência da Edição de DNA

Em vez de focar em melhorar a tecnologia CRISPR em si, os pesquisadores estão explorando como melhorar o DNA doador usado na edição genética. Isso geralmente envolve criar construções doadoras que incluem as tags desejadas e um marcador para fácil identificação das células editadas. Várias estratégias foram propostas para isso, caindo em duas categorias principais: cassetes baseados em promotores e cassetes multicistrônicos.

Os cassetes baseados em promotores incluem uma tag de gene seguida por um promotor separado que impulsiona a expressão de um marcador. Nos cassetes multicistrônicos, outros elementos ajudam a expressar o marcador junto com a tag. Infelizmente, esses métodos existentes costumam ser complicados, dificultando o uso eficaz em muitos laboratórios.

#O Desenvolvimento do Sistema qTAG

Em resposta a esses desafios, um novo conjunto de cassetes de reparo otimizados chamado “quickTAG” (qTAG) foi desenvolvido. Esse sistema visa simplificar o processo de edição e a seleção de linhagens celulares marcadas. O sistema qTAG oferece um design de plasmídeo direto que pode se adaptar facilmente a diferentes tags e marcadores.

O design desses plasmídeos permite tanto marcação fluorescente quanto não fluorescente, tornando-os versáteis para diferentes experimentos. Além disso, fornece orientações sobre prazos e estratégias para obter linhagens celulares homozigóticas. Ao oferecer esses plasmídeos em uma plataforma pública, o objetivo é tornar a marcação de genes mais acessível e incentivar pesquisadores a adotarem esse sistema para estudos futuros.

#Recursos do Sistema qTAG

Os cassetes qTAG são baseados em uma estrutura bem conhecida que apresenta várias características importantes para melhorar a usabilidade. Esses elementos incluem:

1. Opções de Design: O sistema oferece designs para adicionar tags nas duas extremidades de um gene.
2. Clonagem Fácil: Sequências específicas de clonagem incluídas no design facilitam o trabalho com diferentes tags e marcadores.
3. Customização: Locais de restrição exclusivos permitem mudanças diretas nas tags ou marcadores.
4. Remoção de Marcador: Locais especiais de lox flanqueiam o gene marcador, permitindo sua remoção após o processo de marcação.

#Usando o Sistema qTAG em Experimentos

#Editando Proteínas Fluorescentes com o Sistema qTAG

Para testar como o sistema qTAG funciona, os pesquisadores focaram em marcar uma proteína histona específica-H2BC11-com uma proteína fluorescente chamada moxGFP. Foi criada uma estratégia para inserir o marcador moxGFP no gene H2BC11, permitindo que os pesquisadores rastreassem sua localização e comportamento nas células.

Diferentes métodos de edição foram aplicados, mostrando que ambas as técnicas conseguiram introduzir a tag no gene da histona. Após a seleção, houve um aumento notável nas células com a proteína fluorescente desejada, confirmando a eficácia do processo de marcação.

Além disso, esses métodos de marcação foram testados em diferentes linhagens celulares humanas, resultando em taxas de sucesso semelhantes após a seleção. Testes com outros marcadores de seleção também geraram resultados positivos, confirmando a flexibilidade do sistema qTAG.

#Marcação Gênica Serial e Remoção de Marcador

O próximo passo explorou como o sistema qTAG permite a recuperação da resistência a antibióticos após a marcação de um gene. Os pesquisadores miraram em dois genes: TUBB4B e H3C2. Eles primeiro inseriram uma tag fluorescente no TUBB4B e, em seguida, usaram uma técnica para remover o gene marcador seletivo. Esse método produziu uma linhagem celular que poderia ser usada para novas marcações sem reter a resistência anterior.

#Aplicações de Marcação Não Fluorescente

A adaptabilidade do sistema qTAG vai além da marcação fluorescente. Os pesquisadores demonstraram como usar tags não fluorescentes para explorar interações e degradação de proteínas. Ao acoplar essas tags com marcadores seletivos, puderam isolar eficientemente as proteínas marcadas para estudo.

Por exemplo, a proteína da membrana nuclear LMNB1 foi marcada com várias sequências não fluorescentes. Isso incluiu ligases de biotina para estudar interações de proteínas, tags de degradação direcionada para analisar a rotatividade das proteínas, e tags de epítopo para situações onde anticorpos específicos não estavam disponíveis.

#Expandindo as Capacidades do qTAG

Uma das forças do sistema qTAG é seu potencial de expansão. Os pesquisadores começaram a incorporar novas tags mais brilhantes, como a mStayGold recém-desenvolvida. Essa tag é especialmente útil para imagem de proteínas por longos períodos, já que é mais resistente à perda de brilho.

Ao trocar facilmente tags antigas por novas, os cientistas podem explorar uma variedade maior de aplicações. Por exemplo, a mStayGold permite que os pesquisadores rastreiem proteínas em níveis naturais, o que pode trazer novas descobertas em imagem de células vivas.

#Modificando a Estrutura do qTAG para Diferentes Aplicações

O sistema qTAG não é limitado ao seu design original. Os pesquisadores são incentivados a modificar a estrutura para atender a diferentes necessidades experimentais. Por exemplo, eles podem substituir os links de peptídeo 2A por um promotor para melhorar a seleção ao trabalhar com genes de baixa expressão.

Essa flexibilidade abre portas para a criação de cassetes que podem lidar com cenários mais complexos, como gerar knockouts de genes-alvo ou garantir que a integração ocorra em locais específicos dentro do genoma.

#Knockouts Selecionáveis

Ao ajustar o sistema qTAG para acomodar knockouts selecionáveis, os pesquisadores podem criar rapidamente interrupções gênicas. Esse novo método simplifica o processo, tornando-o mais rápido e eficiente do que as abordagens tradicionais.

#Integração em Refúgios Seguros

Outra aplicação inovadora do sistema qTAG envolve a integração em locais “seguros” no genoma. Locais seguros fornecem pontos estáveis onde novo material genético pode ser inserido com mínima interrupção à célula hospedeira. Isso garante que os novos elementos funcionem corretamente sem comprometer funções celulares essenciais.

#Conclusão

Através do desenvolvimento e aplicação do sistema qTAG, os pesquisadores criaram uma plataforma versátil para entender a função gênica. Esse sistema fornece ferramentas acessíveis que facilitam a marcação de genes e o estudo de seu comportamento em células vivas. Ao permitir modificações fáceis e adaptabilidade, o sistema qTAG tem potencial para uma ampla gama de aplicações futuras na biologia molecular.