Novas Descobertas sobre PIDD1 e Proteínas Alternativas

Em humanos, os genes que fazem proteínas geralmente focam em uma parte principal chamada quadro de leitura aberto (ORF) ou sequência codificadora (CDS). Normalmente, esse é o ORF mais longo. O RNA resultante desses genes pode apresentar pequenas mudanças devido ao splicing alternativo. Esse processo permite que os genes criem diferentes formas de proteínas. No entanto, os pesquisadores estão descobrindo que alguns genes podem realmente criar mais de um tipo de ORF, levando à produção de múltiplas proteínas.

Atualmente, não há uma maneira acordada de nomear esses ORFs adicionais e suas proteínas. Eles costumam ser chamados de microproteínas ou proteínas alternativas. Neste estudo, usaremos os termos "ORFs alternativos" (AltORFs) e "proteínas alternativas" (altProts) para diferenciá-los dos principais tipos de proteínas, chamados de "ORFs de referência" (refORFs) e "proteínas de referência" (refProts).

#Importância das Proteínas Alternativas

Um estudo inicial analisou duas proteínas do mesmo gene humano e descobriu que um tipo de proteína alternativa, chamada altMID51, estava presente em quantidades muito maiores do que a proteína de referência. A descoberta de altMID51 como parte da maquinaria da célula chamada mitoribossomo foi importante. Esse exemplo mostra como olhar para essas proteínas alternativas pode oferecer novos insights que poderiam ser perdidos se focássemos apenas nas proteínas principais.

Para estudar como as proteínas são feitas, os cientistas podem usar técnicas como perfilagem de ribossomos (ribo-seq) para entender a produção de proteínas no nível do RNA, ou espectrometria de massa (MS) para estudá-la no nível da proteína. No entanto, identificar altORFs e altProts continua desafiador porque muitas vezes não são nomeados ou reconhecidos em bancos de dados atuais. Essa falta de informação dificulta a descoberta de suas funções.

Para enfrentar esse desafio, alguns estudos combinaram ribo-seq e proteômica. Essa mistura ajuda a anotar altORFs e altProts. Um recurso chamado OpenProt permite que os cientistas encontrem mais de um ORF em um transcrito e anotem todos os ORFs que são mais longos que 29 códons em diferentes espécies.

Ao reanalisar grandes conjuntos de dados de ribo-seq e proteômica usando OpenProt, os pesquisadores podem reunir mais evidências sobre a existência de proteínas alternativas e de referência, além de descobrir genes que podem codificar múltiplas proteínas.

#O Gene PIDD1 e Suas Proteínas

Um gene específico, a Proteína Induzida pelo P53 com um Domínio de Morte (PIDD1), codifica uma proteína composta por 910 aminoácidos. Essa proteína é dividida em duas partes durante seu processamento: uma parte N-terminal de 445 aminoácidos (PIDD-N) e uma parte C-terminal de 465 aminoácidos (PIDD-C). A parte C-terminal é ainda dividida para produzir uma proteína menor chamada PIDD-CC.

PIDD1 desempenha várias funções no corpo, interagindo com diferentes proteínas para responder a danos no DNA, monitorar centrosomas, ativar uma via chamada NFkB e desencadear a morte celular. Mudanças ou mutações no gene PIDD1 têm sido ligadas a anormalidades cerebrais e deficiências intelectuais, embora os motivos exatos ainda não estejam totalmente claros.

Neste estudo, foi descoberto que PIDD1 está entre os possíveis genes multicodificadores, onde tanto a proteína de referência quanto uma proteína alternativa chamada altPIDD1 são produzidas a partir de ORFs sobrepostos encontrados no mesmo transcrito. AltPIDD1 é uma nova proteína que se localiza parcialmente dentro das estruturas do esqueleto da célula e é clivada durante o processo de apoptose (morte celular programada). Enquanto muitas novas proteínas aparecem em primatas, altPIDD1 surgiu primeiro em mamíferos placentários.

Essas descobertas desafiam as ideias tradicionais de como os genes funcionam em mamíferos e mostram a necessidade de melhores descrições do potencial de codificação dentro de nossos genomas.

#Estrutura do Gene PIDD1

O gene PIDD1 consiste em 16 segmentos conhecidos como exons. A parte principal de codificação de proteínas do PIDD1 começa com o exon 2 e termina com o exon 16. Curiosamente, há um segundo ORF que abrange os exons 2 e 3, que se prevê que crie altPIDD1. De acordo com um banco de dados chamado Ensembl, PIDD1 pode produzir dois tipos de RNA. Importante, ambos os tipos se originam do mesmo RNA, significando que PIDD1 e altPIDD1 são expressos juntos.

#Diferenças Entre altPIDD1 e PIDD1

As sequências de aminoácidos de altPIDD1 e PIDD1 são diferentes porque o ORF de altPIDD1 usa um quadro de leitura diferente do de PIDD1. Como resultado, mesmo que venham do mesmo gene, não são considerados variantes entre si. AltPIDD1 contém uma quantidade alta de prolina (um aminoácido) e inclui vários resíduos de cisteína. Algumas partes da proteína parecem desordenadas, o que pode indicar que ela pode se ligar a outras proteínas. Previsões iniciais sugerem que sua estrutura se parece com fitas, embora essas previsões tenham pontuações de confiança mais baixas.

Dados de múltiplos estudos de proteômica indicam que altPIDD1 está presente em várias linhagens e tecidos celulares humanos. Essas análises sugerem que altPIDD1 é produzido em níveis mais altos do que PIDD1. Ao olhar para os diferentes estágios da atividade do ribossomo, parece que os ribossomos traduzem ativamente altPIDD1 e se agrupam ao redor de seu local de início.

#Medindo Níveis de Proteína

Para determinar os níveis de altPIDD1 e PIDD1 nas células, os pesquisadores usaram técnicas específicas que dependem de versões sintéticas de peptídeos. Essas técnicas ajudaram a confirmar que altPIDD1 é muito mais abundante do que PIDD1, com uma diferença significativa em sua estequiometria.

#Testando a Co-Expressão de altPIDD1 e PIDD1

Para entender melhor como altPIDD1 e PIDD1 são expressos juntos, os pesquisadores projetaram diferentes construções genéticas. Algumas construções expressam apenas uma proteína, enquanto outras permitem que ambas sejam expressas a partir do mesmo RNA. Quando ambas as proteínas foram marcadas, os pesquisadores puderam observar a co-expressão diretamente através de imunoblotting.

Os dados mostraram que tanto altPIDD1 quanto PIDD1 estão presentes quando co-expressos a partir do mesmo RNA. Se o local de iniciação de altPIDD1 for removido, PIDD1 ainda é produzido, confirmando o ponto de partida esperado para altPIDD1.

Quando os níveis de expressão de altPIDD1 foram comparados com os de PIDD1, altPIDD1 consistentemente mostrou níveis mais altos, mesmo em condições de baixa expressão. Em experimentos que previnem a síntese de proteínas, altPIDD1 permaneceu estável enquanto PIDD1 foi processado mais rapidamente. Isso sugere que altPIDD1 pode ser feito de forma mais eficiente pela maquinaria celular.

#Efeitos da Sequência de Iniciação

Em mamíferos, há uma sequência ideal para iniciar a síntese de proteínas conhecida como motivo de Kozak. A sequência ao redor de altPIDD1 fornece alguns bons sinais, mas falta um nucleotídeo importante. Como resultado, a tradução de PIDD1 pode depender de um processo de varredura vazada, levando os ribossomos a ignorar o local de início de altPIDD1 e se moverem em direção ao local de PIDD1.

Os pesquisadores testaram essa ideia modificando o local de iniciação de altPIDD1 para se alinhar com a sequência ideal de Kozak. Essa mudança resultou em níveis reduzidos de PIDD1, confirmando a hipótese da varredura vazada.

#Localização de altPIDD1

Para entender onde altPIDD1 é encontrado nas células, os pesquisadores usaram técnicas de imagem especiais. Tanto altPIDD1 quanto PIDD1 foram localizados principalmente no citoplasma. No entanto, altPIDD1 também apareceu em áreas distintas ao longo das bordas da célula ou em estruturas filamentosas específicas, levando os pesquisadores a acreditar que pode se conectar com partes do esqueleto celular ricas em uma proteína chamada actina.

Para validar essas observações, os cientistas induziram células a criar estruturas que dependem da actina e descobriram que altPIDD1 se acumulou nessas áreas.

#Interações com Outras Proteínas

Para descobrir com quais proteínas altPIDD1 interage nas células, os pesquisadores usaram técnicas para purificá-lo e analisar o que mais estava presente. Várias proteínas conhecidas por estarem conectadas ao esqueleto celular foram identificadas. Uma proteína, chamada calpain-2, foi particularmente enriquecida na rede de interações.

Essa interação foi confirmada através de experimentos que demonstraram que altPIDD1 poderia puxar calpain-2. Dado que calpain-2 tem um papel na clivagem de proteínas e movimento, essa interação pode ser crucial para entender o que altPIDD1 faz dentro da célula.

#Papel de altPIDD1 na Morte Celular

AltPIDD1 também contém um local onde pode ser clivado por enzimas específicas durante um tipo de morte celular programada chamada apoptose. Os pesquisadores testaram isso induzindo a morte celular e verificando se altPIDD1 estava sendo clivado. Eles descobriram que o tratamento com UV levou a uma clivagem significativa de altPIDD1, que foi interrompida quando um inibidor específico estava presente. Uma mutação projetada para prevenir a clivagem confirmou essa função, reforçando a ideia de que altPIDD1 está envolvido no processo de morte celular.

#Evolução de altPIDD1

Ao olhar para a árvore evolutiva do gene PIDD1, os pesquisadores descobriram que altPIDD1 é principalmente conservado em mamíferos placentários. No entanto, ele não aparece em outros tipos de mamíferos, sugerindo que essa proteína alternativa surgiu depois que os mamíferos placentários evoluíram.

#Conclusão

A tradução de proteínas a partir de ORFs alternativas está ganhando atenção enquanto os pesquisadores descobrem novas proteínas que antes não eram reconhecidas. Nosso estudo mostrou que o gene PIDD1 produz uma proteína alternativa, altPIDD1, que é o principal produto desse gene, e não a proteína de referência tradicional.

Usar várias fontes de dados e reanalisar estudos existentes pode fornecer insights valiosos sobre essas proteínas alternativas. Este estudo destaca a necessidade de mais exploração de genes multicodificadores para entender melhor suas contribuições para o panorama proteico mais amplo em nossas células.

#Direções Futuras

Para entender completamente a função de altPIDD1, mais pesquisas são necessárias. É essencial investigar como sua presença afeta PIDD1 e os processos celulares mais amplos envolvendo as proteínas com as quais interage. Remover altPIDD1 seletivamente ajudará a esclarecer seus papéis específicos dentro da célula e determinar se realmente desempenha uma função essencial ou se é apenas um subproduto da maquinaria celular.

Este estudo estabelece a base para pesquisas mais extensas sobre a importância das proteínas alternativas e seus papéis na saúde e na doença. Ao empregar técnicas avançadas e uma abordagem colaborativa, os cientistas podem desvendar ainda mais os mistérios da expressão gênica e da função das proteínas em organismos vivos complexos.