Avanços no Sequenciamento de DNA para a Segurança Alimentar

Verduras folhosas podem causar sérios problemas de saúde. Nos Estados Unidos, quase metade dos surtos ligados a uma bactéria perigosa chamada Escherichia Coli produtora de toxina Shiga (STEC) vem dessas verduras. Recentemente, estudos apontaram a água agrícola como uma possível fonte do problema. Atualmente, quando há um surto, a Administração de Alimentos e Medicamentos (FDA) leva de 2 a 4 semanas para descobrir a causa por meio de testes de laboratório. Esse tempo pode ser crítico, já que alimentos frescos estragam rápido, tornando essencial ter métodos mais ágeis para identificar produtos inseguros.

Pra rastrear e entender surtos, a FDA usa uma tecnologia chamada sequenciamento de genoma completo (WGS) com instrumentos feitos pela Illumina. Embora o método da Illumina seja preciso, ele tem dificuldades em lidar com partes complicadas do genoma bacteriano que são repetitivas. Como resultado, quando os cientistas montam o genoma de uma cepa bacteriana envolvida em um surto, muitas vezes acaba em várias peças ao invés de uma imagem completa. Isso pode levar à falta de dados importantes, como se a bactéria pode resistir a antibióticos.

Uma abordagem alternativa é usar tecnologia de sequenciamento de leitura longa da Oxford Nanopore Technologies (ONT). Esse método consegue ler trechos maiores de DNA, ajudando a identificar a bactéria certa mais rápido. Porém, as versões anteriores dessa tecnologia tinham menor precisão e não eram confiáveis para algumas análises. Recentemente, a ONT apresentou um novo método chamado Q20+ que promete maior precisão e melhor resultado. Esse avanço pode tornar a ONT uma opção melhor para responder a surtos de doenças transmitidas por alimentos.

Antes de adotarmos o sequenciamento da ONT mais amplamente, precisamos garantir que sua qualidade corresponda à do método da Illumina. Um estudo piloto focando a nova tecnologia da ONT foi feito para encontrar as melhores combinações de kits de preparação de biblioteca e dispositivos de sequenciamento. A FDA tem diretrizes que afirmam que coisas específicas devem ser verificadas durante esse tipo de validação, incluindo o uso de cepas bacterianas bem conhecidas e garantindo que os resultados sejam confiáveis, tanto entre diferentes execuções quanto dentro da mesma.

#Design do Estudo

Para este estudo piloto, cinco cepas bem conhecidas de bactérias que podem causar doenças transmitidas por alimentos foram selecionadas. Essas cepas incluíram Salmonella enterica, Vibrio parahemolyticus, Shigella sonnei, Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae. As bactérias foram cultivadas em laboratório e armazenadas para testes.

#Extração de DNA

Para analisar essas cepas, o DNA foi extraído usando dois métodos diferentes. O primeiro método envolveu uma máquina que permite uma extração mais rápida, mas produz DNA que quebra fácil. O segundo método foi mais manual, mas rendeu DNA de alta qualidade. Os dois tipos de DNA extraído foram usados com dois kits de preparação de biblioteca diferentes para se prepararem para o sequenciamento.

#Sequenciamento de Genoma Completo

O DNA extraído passou por sequenciamento usando um dispositivo da Oxford Nanopore. O processo envolveu rodar as amostras por dois protocolos diferentes durante a fase de sequenciamento. Após o sequenciamento, as leituras que não atenderam a um determinado limiar de qualidade foram removidas. As leituras de alta qualidade foram então montadas em genomas bacterianos completos usando um software chamado Flye.

Para comparar os resultados da ONT, as mesmas cepas bacterianas também foram sequenciadas com um dispositivo diferente, o Illumina MiSeq. O método da Illumina fornece leituras curtas de alta qualidade, que também foram montadas para comparação.

#Análise de Dados

Após o sequenciamento, o próximo passo foi analisar os dados do genoma resultante. Cada genoma montado foi verificado para identificação correta da espécie bacteriana. Isso foi feito usando uma ferramenta chamada Kraken 2. A precisão foi medida para garantir que a espécie correta fosse identificada.

#Genotipagem

Outras análises incluíram identificar o tipo de bactéria, sua Resistência a Antibióticos e quaisquer fatores de virulência que ela possa ter. Ferramentas específicas foram usadas para analisar e identificar essas propriedades com base nos dados do sequenciamento do genoma.

#Análise Filogenética

A relação entre diferentes cepas bacterianas foi avaliada usando um método conhecido como wgMLST. Esse método compara vários genes entre as bactérias para ver quão próximas elas estão. Uma árvore filogenética foi criada para visualizar essas relações.

#Resultados

O estudo descobriu que ambos os métodos de extração de DNA funcionaram bem, embora houvesse diferenças na qualidade e completude dos genomas obtidos em cada execução. A maioria dos genomas montados estava completa, recuperando mais de 99% dos genes esperados.

#Desempenho da Tecnologia ONT

A tecnologia Q20+ da ONT produziu resultados de alta qualidade. Para identificação de espécies, a precisão foi de 100%, significando que cada cepa testada foi identificada corretamente. O mesmo vale para a identificação de genes de resistência a antibióticos e fatores de virulência. As montagens da ONT mostraram que se agruparam de perto com genomas de referência quando analisadas, indicando um desempenho confiável.

#Observações sobre a Qualidade dos Dados

Apesar do desempenho geral ser forte, algumas inconsistências foram observadas. Por exemplo, certos comprimentos de montagem variaram significativamente entre diferentes execuções. Algumas genes faltantes foram notados, e problemas de montagem estavam presentes em alguns casos. Essas descobertas sugerem que, embora a tecnologia ONT seja promissora, ela pode precisar de mais otimização para resultados consistentes entre várias cepas.

#Implicações para a Segurança Alimentar

Essa pesquisa é significativa porque aborda a necessidade de métodos mais rápidos de identificação para patógenos transmitidos por alimentos. Atualmente, o tempo que leva para identificar e resolver surtos é um grande desafio. Métodos rápidos e precisos poderiam ajudar os oficiais de saúde pública a responder de forma mais eficaz, minimizando os riscos à saúde associados a alimentos contaminados.

Além disso, o uso da tecnologia ONT poderia ser um divisor de águas em investigações de surtos. Ela pode oferecer uma abordagem mais eficiente em comparação aos métodos tradicionais usados hoje. Reduzindo o tempo necessário para identificar bactérias nocivas, as respostas de segurança alimentar poderiam se tornar mais rápidas e eficazes.

#Conclusão

O estudo piloto mostra o potencial da tecnologia de sequenciamento ONT como uma alternativa viável aos métodos tradicionais para identificar patógenos transmitidos por alimentos. Embora ainda haja desafios para alcançar resultados consistentes, a alta precisão e velocidade da ONT podem melhorar significativamente as medidas de segurança alimentar. Estudos futuros são necessários para otimizar esses métodos e integrá-los totalmente nas estratégias regulares de vigilância e resposta.

Melhorias contínuas em tecnologias de sequenciamento como a ONT serão cruciais para a saúde pública. Elas prometem não apenas melhorar as respostas a surtos de doenças transmitidas por alimentos, mas também aumentar a compreensão geral das doenças bacterianas.