Avançando a pesquisa do intestino com organoides suínos

O trato gastrointestinal (TGI) é super importante pra quebrar a comida, absorver nutrientes, eliminar resíduos e manter o corpo em equilíbrio. O revestimento do TGI tem um papel chave, controlando o que pode passar por ele, tipo nutrientes, sal e água. Tem umas proteínas especiais chamadas proteínas de junção apertada que ajudam a manter esse revestimento intacto e funcionando. Essas proteínas atuam como uma barreira e também como uma passagem pra coisas entrarem e saírem.

Uma camada de muco, criada por células caliciformes, protege o revestimento de germes e danos físicos. Canais e Transportadores diferentes ajudam a mover substâncias específicas dentro e fora das células. A galera que pesquisa, geralmente estuda o TGI usando modelos animais, com porcos sendo uma escolha popular porque as condições intestinais deles são parecidas com as dos humanos. Mas estão aparecendo preocupações crescentes sobre a ética de usar animais pra pesquisa. Por causa disso, os cientistas estão buscando métodos alternativos como culturas de células pra estudar o TGI.

#A Necessidade de Modelos Melhores

Embora as linhagens celulares sejam úteis pra algumas pesquisas, elas costumam focar só em um tipo de célula. O cólon tem muitos tipos diferentes de células, cada uma com sua função. Pra representar melhor essas diferenças, os pesquisadores desenvolveram modelos de Organoides, começando em 2009. Os organoides são aglomerados de células que podem crescer em diferentes tipos de células epiteliais e podem se renovar. Quando cultivados em uma camada bidimensional, esses organoides podem fornecer informações valiosas pra entender como o intestino funciona.

Um objetivo específico é examinar como os organoides de cólon de porco funcionam em nível celular, incluindo como eles expressam certos genes em comparação com o tecido real. Este estudo também vai analisar como esses organoides transportam substâncias, que é importante pra sua função em nutrição e saúde.

#Criando Organoides 3D e 2D

Pra fazer organoides 3D, os pesquisadores primeiro isolam criptas intestinais do tecido do cólon de porco. Eles então cultivam isso em um gel especial chamado Matrigel, que fornece o ambiente certo pra os organoides se desenvolverem. Os pesquisadores mudam cuidadosamente o meio de crescimento a cada poucos dias e separam quaisquer aglomerados que fiquem muito grandes.

Pra criar organoides 2D, eles pegam organoides 3D já estabelecidos e quebram eles em camadas únicas. Depois de tratar essas camadas com algumas enzimas, as células são contadas e colocadas em inserts especiais de cultura celular. Os pesquisadores trocam o meio a cada dois dias e medem quão bem as células estão formando conexões entre si.

#Analisando as Células

No décimo dia de crescimento, os pesquisadores coletam as células pra analisar suas características. Eles usam vários métodos pra estudar a Expressão Gênica das proteínas de junção apertada, que são essenciais pra manter a função de barreira do revestimento intestinal.

Usando kits específicos, os pesquisadores extraem RNA das células pra determinar quanto de certos genes estão sendo expressos. Comparando as culturas de organoides 2D com o tecido nativo do cólon, eles conseguem ver se os organoides realmente refletem o tecido real.

#Monitorando a Função de Barreira

Uma forma de avaliar a saúde da camada celular é medindo sua Resistência Elétrica, conhecida como resistência elétrica transepitelial (TEER). Um TEER mais alto indica uma barreira mais forte, que é necessária pra que o intestino funcione direito. Neste estudo, os valores de TEER aumentaram com o tempo, atingindo um ponto estável após o oitavo dia de crescimento.

Usando microscopia eletrônica, os pesquisadores podem confirmar visualmente a integridade da camada. Eles descobrem que a camada de organoides tem microvilos bem formados e células caliciformes que produzem muco, ambas características importantes de um cólon saudável.

#Expressão Gênica em Organoides

O próximo passo é avaliar se os organoides expressam genes-chave que são cruciais para a função do intestino. Os pesquisadores focam em genes responsáveis por transportar substâncias importantes como sódio e cloreto. Eles descobrem que a expressão desses genes na cultura de organoides 2D é comparável à do tecido nativo.

Essa semelhança é significativa porque mostra que os organoides podem ser usados pra estudar como o intestino funciona em termos de absorção e secreção de nutrientes. A expressão gênica das mucinas, que são componentes importantes do muco, também não apresentou diferenças significativas ao comparar organoides com tecido nativo.

#Investigando a Fisiologia do Transporte

Pra estudar melhor como as substâncias se movem pela camada de organoides, os pesquisadores usaram uma ferramenta chamada câmara de Ussing. Esse método permite medir como as correntes elétricas mudam quando certas substâncias são adicionadas. Por exemplo, adicionar glicose à camada de organoides causou um aumento na corrente elétrica, indicando que a glicose estava sendo absorvida corretamente, demonstrando a atividade do transportador sódio-glicose.

Os pesquisadores também testaram como outras substâncias influenciaram a corrente, como a forskolina, que aumenta a secreção de cloreto. Eles observaram que a adição de forskolina levou a mudanças significativas na corrente elétrica, sugerindo que os organoides podem imitar a resposta do tecido nativo.

#Impacto da Amilorida nos Canais de Sódio

A amilorida é um remédio que pode bloquear a entrada de sódio nas células. Os pesquisadores testaram como diferentes concentrações de amilorida afetaram a corrente elétrica nos organoides. Eles descobriram que em certas concentrações, a amilorida diminuía a corrente, mostrando que estava influenciando os canais de sódio como esperado.

Quando os organoides foram pré-tratados com aldosterona, um hormônio que aumenta a absorção de sódio, os pesquisadores queriam ver se isso mudaria a resposta da corrente. No entanto, eles descobriram que a adição de aldosterona não teve um efeito significativo na corrente.

#A Importância da Função de Barreira

A camada epitelial no cólon é responsável por agir como uma barreira que controla o que pode passar por ela, além de proteger contra substâncias nocivas. A presença de microvilos e células caliciformes na camada de organoides é consistente com o que é observado em um cólon saudável.

Essa função de barreira é crucial pra absorção de nutrientes e prevenção de infecções. A expressão gênica e a funcionalidade observadas sugerem que os organoides são capazes de manter uma barreira seletiva, similar ao tecido natural.

#Funcionalidade de Transportadores e Canais

As proteínas de transporte e canais desempenham um papel significativo na função do cólon. Os níveis de expressão de certas proteínas, como transportadores de sódio e cloreto, permaneceram consistentes entre os organoides e o tecido nativo do cólon. Essa consistência indica que os organoides podem ser usados pra estudos futuros.

Os pesquisadores usaram a câmara de Ussing pra testar quão bem esses transportadores funcionavam nas culturas de organoides. Eles descobriram que os organoides respondiam à glicose de forma semelhante ao que o tecido natural faria, embora houvesse algumas diferenças na intensidade da resposta.

#Conclusão

O objetivo dessa pesquisa foi criar um modelo in vitro que representasse com precisão o cólon de porco pra estudar suas propriedades funcionais. Os resultados mostram que a cultura 2D de organoides de cólon de porco pode formar uma monocamada densa e saudável, igual ao tecido natural. Os padrões de expressão gênica são semelhantes, indicando que os organoides são bons modelos pra pesquisa.

Esse estudo demonstra que tais modelos têm o potencial de substituir testes em animais pra certos projetos de pesquisa, alinhando-se aos princípios éticos que incentivam a redução, substituição e aprimoramento do uso de animais em experimentos. As descobertas também fornecem uma base sólida pra estudos futuros relacionados à fisiologia colônica e doenças.