Avançando a Biologia Sintética com a Tecnologia CRISPR

A biologia sintética é um campo que se concentra em criar novas partes e sistemas biológicos. Um dos seus principais objetivos é construir circuitos de tomada de decisão programáveis que possam realizar funções específicas. Esses circuitos agem como computadores biológicos, processando informações e reagindo a diferentes sinais.

No passado, a maioria dos circuitos sintéticos dependia de proteínas chamadas fatores de transcrição para controlar a atividade gênica. No entanto, à medida que os cientistas tentavam criar circuitos mais complexos, perceberam que usar fatores de transcrição trazia desafios. Cada nova proteína precisava ser testada para garantir que funcionasse bem com as outras proteínas no circuito, o que tornava difícil construir sistemas mais intrincados. Além disso, altos níveis de proteínas poderiam consumir muitos recursos das células onde esses circuitos eram feitos, desacelerando o crescimento celular e causando instabilidades.

Para superar essas limitações, os pesquisadores começaram a olhar para reguladores baseados em RNA, focando especialmente em um sistema chamado CRISPR. O CRISPR faz parte de um mecanismo de defesa natural em bactérias e oferece uma maneira robusta de controlar a expressão gênica usando RNA. Uma variante desse sistema, conhecida como dCas9, pode ser direcionada para quase qualquer sequência de DNA usando RNAs guias específicos. Quando dCas9 é direcionado para regiões gênicas, ele pode bloquear a maquinaria responsável por ler genes, efetivamente desligando-os.

O CRISPR tem várias vantagens sobre reguladores de proteínas tradicionais. Seu design é flexível, tornando mais fácil criar diferentes RNAs guias que podem ser usados em várias situações. Essa flexibilidade permite que os cientistas simulem como diferentes circuitos podem se comportar em diversos ambientes. Integrar outras proteínas ao sistema CRISPR dá aos pesquisadores ainda mais ferramentas para trabalhar ao projetar circuitos gênicos. Além disso, o CRISPR tem um impacto menor nas células hospedeiras, já que requer menos material genético em comparação com sistemas baseados em proteínas.

#Os Desafios do Uso do CRISPR

Apesar das características promissoras do CRISPR, a superprodução da proteína dCas9 pode prejudicar as funções normais da célula e levar a problemas celulares. Assim, os pesquisadores estão agora focando em desenvolver sistemas CRISPR fora das células vivas, em sistemas livres de células. Esses sistemas permitem testar circuitos gênicos mais rapidamente, construir células sintéticas e desenhar vias biológicas sem as limitações de organismos vivos.

Atualmente, há poucos exemplos de circuitos gênicos eficazes que podem controlar vários genes de forma dinâmica em sistemas livres de células. Para abordar essa lacuna, os pesquisadores estão adotando uma plataforma comum, o sistema T7 RNAP, que simula a transcrição em um ambiente controlado. Esse sistema é reconhecido pela sua consistência, pois geralmente tem taxas mais baixas de degradação de proteínas e RNA.

#Simplificando o Design de Circuitos

Criar circuitos sintéticos pode ser uma tarefa trabalhosa porque cada parte precisa ser projetada independentemente. Inspirados pela forma como os circuitos eletrônicos funcionam, os pesquisadores estão desenvolvendo um novo método de design usando CRISPR. Esse método permite que vários Portas Lógicas compartilhem a mesma saída e unidades de processamento, variando apenas seus módulos de entrada. Mudando apenas as entradas, as saídas podem ser ajustadas adequadamente.

Por exemplo, eles projetaram portas NOR e NAND que operam de forma semelhante, exigindo apenas diferentes RNAs guias para gerar várias saídas. Após testar essa abordagem, eles conseguiram desenvolver portas lógicas em múltiplos níveis, como portas AND e OR, que compartilham os mesmos módulos de saída. Essa abordagem reduz significativamente a complexidade e as exigências do design do circuito.

#Construindo e Testando Circuitos Sintéticos

Em seus experimentos, os pesquisadores construíram Plasmídeos, que são pequenos círculos de DNA usados para engenharia genética. Eles usaram sequências específicas para criar seus sistemas e os transformaram em bactérias para crescer e amplificar os circuitos. Todas as sequências foram cuidadosamente planejadas para garantir que funcionassem como pretendido.

Para avaliar a função dos circuitos, configuraram reações de transcrição onde transcreveram DNA para RNA usando o sistema T7. Vários genes repórteres foram usados para visualizar a saída, permitindo que os pesquisadores medissem o quão bem os circuitos operavam. Eles então verificaram os efeitos dos RNAs guias nesses sistemas, observando sinais de fluorescência.

#Observações dos Experimentos

Os resultados dos testes mostraram o quão efetivamente os circuitos sintéticos podiam funcionar. Eles descobriram que diferentes RNAs guias podiam aumentar ou reduzir os níveis de transcrição, dependendo de como eram configurados. Notavelmente, quando certos RNAs guias eram usados em conjunto, eles podiam melhorar significativamente a repressão da expressão gênica.

Além disso, os pesquisadores descobriram que era possível criar sinais em cascata, onde um RNA guia podia influenciar as ações de outro, levando a uma saída mais complexa. Essa capacidade de cascata permite uma lógica em camadas intrincada dentro dos circuitos.

#Avanços no Design de Portas Lógicas

Uma grande descoberta na pesquisa foi a realização de que nós CRISPR poderiam ser encadeados várias vezes para criar portas lógicas avançadas. Eles projetaram circuitos que podiam incorporar operações “AND” e “OR” combinando diferentes RNAs guias. Essa abordagem inovadora possibilita a criação de circuitos mais complexos que podem realizar múltiplas funções com um único conjunto de componentes.

#Criação de Portas Lógicas

As portas lógicas que criaram incluíam configurações onde o resultado dependia de múltiplas entradas que precisavam estar presentes (portas AND) ou apenas uma delas sendo suficiente (portas OR). Essas portas demonstraram que podiam gerenciar e transmitir sinais de maneira eficiente, enfatizando o aspecto modular de seu design, que minimiza a necessidade de várias partes únicas.

#Direções Futuras na Biologia Sintética

O avanço dos circuitos gênicos sintéticos utilizando a tecnologia CRISPR apresenta um futuro promissor para várias aplicações. Embora um progresso significativo tenha sido feito, ainda há desafios a serem abordados. Testar esses circuitos dentro de células vivas é o próximo passo, o que permitirá uma compreensão mais profunda de suas aplicações práticas.

Além disso, a natureza modular de suas portas lógicas tem o potencial de criar sistemas altamente complexos, permitindo que os pesquisadores explorem inúmeras configurações e saídas. Essa flexibilidade pode levar a usos inovadores em várias áreas, incluindo medicina, biotecnologia e ciência ambiental.

Resumindo, a pesquisa representa um passo crítico em direção à construção de circuitos gênicos sintéticos eficientes e versáteis. Ao simplificar o processo de design e minimizar redundâncias, os cientistas podem se concentrar em criar sistemas biológicos avançados que poderiam transformar nossa abordagem a muitos desafios científicos e práticos no futuro.