Novo Método de Teste para a Peste Suína Africana
Uma ferramenta promissora pra detectar rapidamente a Peste Suína Clássica em porcos tá sendo desenvolvida.
Sekhar Kambakam, Julia Thomas, Suelee Robbe-Austerman, Karthik Shanmuganatham, Rachel Palinski
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Índice
A Febre Suína Africana (FSA) é uma doença viral que afeta porcos, tanto os domésticos quanto os selvagens. Essa doença é causada por um vírus conhecido como Vírus da Febre Suína Africana (VSFA). Ele faz parte de um grupo de vírus que são conhecidos por sua estrutura complexa. O VSFA tem uma grande quantidade de material genético, especificamente DNA de dupla fita, e consegue produzir mais de 160 proteínas diferentes que ajudam seu funcionamento.
A FSA é famosa por ser super contagiosa. Isso significa que se um porco for infectado, pode espalhar rapidamente para os outros, causando problemas sérios para os criadores de porcos. O VSFA pode ser transmitido de porco para porco pelo contato direto, mas também pode sobreviver fora dos porcos por um bom tempo. Ele pode ficar no ambiente, na ração, nos equipamentos ou até nas roupas. Por causa disso, o vírus pode causar grandes preocupações para a indústria de carne suína no mundo todo.
Os porcos infectados podem apresentar uma variedade de sintomas. Eles costumam desenvolver febre alta e podem ficar lethargicos, perder o apetite, vomitar, ter diarreia e até sofrer de sangramentos e dificuldades para respirar. Nos casos mais graves, os porcos podem morrer rapidamente, às vezes em menos de uma semana, e a taxa de mortalidade pode chegar a 100%.
Origens e Disseminação da FSA
Acredita-se que a FSA tenha começado na África Subsaariana, onde o vírus ainda está presente entre as populações locais de porcos. Ao longo dos anos, surtos aconteceram na Europa e nas Américas, embora muitos tenham sido controlados.
Um surto significativo aconteceu na Geórgia em 2007, levando o vírus a se espalhar entre as populações de javalis na Europa Oriental. Por mais de uma década, a FSA ficou relativamente contida até que as medidas de biossegurança fossem rompidas, permitindo que se espalhasse rapidamente para a China em 2018. Esse surto teve efeitos dramáticos, causando um colapso na indústria de criação de porcos do país.
Em 2021, o vírus foi detectado na ilha caribenha da Hispaniola, e esse surto ainda está em andamento, o que levanta preocupações para países como os Estados Unidos. Para combater essa ameaça, os EUA intensificaram seus esforços para monitorar e controlar a FSA. Eles implementaram medidas rigorosas para impedir o movimento de carne suína e produtos relacionados de territórios afetados, na esperança de proteger sua população de porcos domésticos.
A Necessidade de Diagnóstico Eficaz
Dada o sério impacto da FSA, a detecção rápida e precisa é vital. Métodos tradicionais como QPCR (que significa Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa) são atualmente o padrão ouro para diagnosticar o VSFA. No entanto, o qPCR requer equipamentos caros, treinamento especial e configurações de laboratório específicas, o que o torna impraticável para uso em áreas com recursos limitados.
Métodos alternativos como RPA (Amplificação por Polimerase Recombinante) e LAMP (Amplificação Isotérmica Mediadas por Loop) foram desenvolvidos, mas não alcançam a precisão do qPCR. Isso é como tentar pegar um animal rápido com uma rede mais lenta. O desafio está em criar testes que sejam tão bons quanto o qPCR, mas simples o suficiente para qualquer um usar, mesmo em áreas remotas.
CRISPR
Uma Abordagem Inovadora: TecnologiaRecentemente, uma nova técnica chamada CRISPR fez sucesso em diversas áreas, incluindo engenharia genética e medicina. Essa tecnologia tem o potencial de ser adaptada para diagnosticar doenças, incluindo a FSA.
Combinando CRISPR com RPA, os pesquisadores estão tentando desenvolver testes mais rápidos e simples que possam ser usados diretamente no local onde os porcos são mantidos. Essa abordagem dupla pode ajudar os criadores a identificar rapidamente infecções e prevenir surtos maiores.
Desenvolvendo um Novo Método de Teste
Nesta pesquisa, os cientistas focaram em criar um novo teste para o VSFA usando RPA emparelhada com a tecnologia CRISPR. Primeiro, eles selecionaram pequenos pedaços de RNA projetados para atingir o VSFA. Isso envolveu testar quão eficazes eram esses pedaços em reconhecer o vírus.
Depois de confirmar que o novo teste poderia identificar o VSFA com precisão, eles garantiram que funcionasse bem com vários tipos de amostras, desde esfregaços de sangue até outros materiais biológicos. O novo método visa fornecer resultados que correspondam aos obtidos por meio do teste tradicional de qPCR, confirmando assim sua confiabilidade.
Como Funciona o Novo Teste
O teste desenvolvido é um processo simples de duas etapas. Na primeira etapa, a RPA amplifica o material genético do vírus se estiver presente na amostra. Essa etapa é realizada a uma temperatura constante, o que facilita o gerenciamento.
Uma vez que o material genético é amplificado, o CRISPR entra em ação. O sistema CRISPR então reconhece e marca o material amplificado do vírus e emite um sinal fluorescente. Se o teste funcionar, a área do teste se acende, semelhante a como uma lâmpada acende quando você liga o interruptor. Essa dica visual é especialmente útil, pois permite checagens rápidas sem precisar de configurações laboratoriais complexas.
Testando o Novo Método
Para garantir que o novo teste funcione corretamente, os pesquisadores realizaram testes extensivos. Eles prepararam amostras de controle positivo contendo DNA do VSFA e testaram essas amostras ao lado de amostras de outros vírus para confirmar que o novo método não estava identificando erroneamente outras infecções virais como FSA.
Os pesquisadores também avaliaram o desempenho do método sob diferentes condições, incluindo o uso de diferentes tipos de amostras que os porcos poderiam passar. Eles até adicionaram concentrações conhecidas de DNA do VSFA para ver se o teste poderia detectá-lo de forma confiável, o que ele fez.
Avaliando a Eficácia
Nestes testes, o novo método demonstrou desempenho sólido. O teste conseguiu identificar com precisão o VSFA tanto em condições controladas quanto em amostras reais coletadas de porcos suspeitos de estarem infectados. Os resultados mostraram um nível impressionante de confiabilidade, correspondendo às descobertas do qPCR e destacando o quão útil esse método poderia ser em campo.
Por que Isso É Importante
O desenvolvimento desse novo teste é crucial porque fornece uma ferramenta essencial para fazendeiros e veterinários. No caso de um surto de FSA, um teste rápido e confiável pode ajudar na detecção precoce e no controle. Um diagnóstico ágil significa que ações rápidas podem ser tomadas para prevenir a propagação do vírus.
Essa inovação pode ser especialmente benéfica em áreas onde os recursos e o acesso a instalações laboratoriais são limitados. Ao capacitar aqueles que estão na linha de frente da criação de porcos, esse teste pode ajudar a proteger a indústria dos efeitos devastadores da FSA.
Conclusão
Em resumo, a ascensão da FSA representa um desafio significativo para a criação de porcos em todo o mundo, afetando o fornecimento de alimentos e a estabilidade econômica. O desenvolvimento de um método de teste simples e eficaz que combina RPA e CRISPR pode mudar a forma como abordamos essa doença.
Com uma ferramenta rápida e precisa para diagnosticar a FSA, podemos ver uma diminuição nos surtos e um risco reduzido para as populações de porcos. Às vezes, é preciso um pouco de criatividade e inovação-como misturar ciência com uma pitada de humor-para superar desafios. Os cientistas estão constantemente trabalhando para reduzir a curva de disseminação de doenças, tornando o mundo um lugar mais seguro para nossos amigos de quatro patas e para os fazendeiros que cuidam deles.
Título: Rapid identification of African swine fever virus in diagnostic samples using CRISPR-Cas
Resumo: African Swine Fever Virus (ASFV) is a high consequence, highly transmissible pathogen affecting swine causing African Swine Fever (ASF), a devastating disease, with high mortality rates in naive populations. Due to the likelihood of significant economic impacts associated with an ASF outbreak, considerable resources have been allocated in the United States (U.S.) to safeguard the swine industry against this threat. Ongoing outbreaks of ASF in the Dominican Republic and Haiti further threaten U.S. swine due to their proximity and involvement in movement to and from North America. While surveillance programs are ongoing, there are limited point-of-care (POC) tests available during outbreaks that maintain the sensitivity and specificity standards of laboratory testing (e.g., qPCR). However, the recently developed CRISPR-Cas testing systems may provide comparable high-quality results. In a CRISPR-based diagnostic assay, CRISPR effectors can be programmed with CRISPR-RNA (crRNA) to target specific DNA or RNA. Upon target binding, the Cas enzyme undergoes collateral cleavage of nearby fluorescently quenched reporter molecules (ssDNA or ssRNA), which can be detected under blue light or a fluorescence microplate reader. Furthermore, this tool is rapid, simple, cost-effective and can be performed with inexpensive equipment. For these reasons, we sought to develop a low-cost visual detection method for ASFV by employing the recombinase polymerase amplification (RPA)-dependent CRISPR-Cas12a technique that can be utilized in the field as a point-of-care-assay. Our CRISPR-Cas12a assay demonstrated comparable sensitivity and specificity to qPCR, both visually and when quantified using a fluorescent reader. In whole blood samples from ASFV-suspect or ASFV-negative cases, the CRISPR assay achieved a sensitivity of 98.3% (102 DNA copies) and a specificity of 100%. Finally, an assessment of the reaction time constraints indicated that results can be visualized in as little as seven minutes with a peak fluorescence at 40 min (RPA and CRISPR steps). The results of this feasibility assay validation allow for the rapid development of sensitive and specific POC tests that may be used for outbreak response in the future.
Autores: Sekhar Kambakam, Julia Thomas, Suelee Robbe-Austerman, Karthik Shanmuganatham, Rachel Palinski
Última atualização: 2024-12-30 00:00:00
Idioma: English
Fonte URL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.27.630508
Fonte PDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.27.630508.full.pdf
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