PUREシステムにおけるDTTがマラカイトグリーンアプタマーに与える影響

細胞フリータンパク質合成（CFPS）システムは、生きた細胞を使わずにタンパク質を生産する方法だよ。このシステムには主に2つのタイプがあるんだ。1つ目は細胞裂解物に基づくもので、細胞からタンパク質や他の細胞の機械を取り出して、直接タンパク質を生産する方法。2つ目は、純粋なタンパク質を既知の量で混ぜて作られるPUREというシステムで、これは純粋な再組換え要素を使ったタンパク質合成を意味するんだ。もう1つのバリエーションとしてOnePot PUREがあって、ここではすべてのタンパク質が一緒に結合されて純化されるよ。

#PUREシステムの理解

PUREシステムを使うことで、研究者はタンパク質合成プロセスの開発を助けるモデルを作ることができる。つまり、新しい遺伝子回路や合成細胞をもっと効果的に設計、構築、テストできるんだ。最近では、研究者が化学反応ネットワークを使ってPUREセットアップでタンパク質がどのように作られるかをシミュレートするモデルを作成してきた。このモデルは、より多くのペプチドと転写プロセスを含めることで改善されている。

これらのモデルが正確であることを確保するためには、転写（RNAの生成）と翻訳（タンパク質の生成）のプロセスの両方を監視することが重要。翻訳は蛍光タンパク質を使って監視することができ、これが輝いてタンパク質の生産を示すんだ。でも、転写を追跡するのはもっと難しくて、特別なRNA配列であるアプタマーに頼ることが多い。マラカイトグリーンアプタマーもその一つだよ。

#マラカイトグリーンアプタマーの役割

マラカイトグリーンアプタマー（MGapt）は最初、酵母の遺伝子発現を制御するために使われたんだ。時間が経つにつれて、研究者たちはMGaptを使ってRNAがどのように生成されるか、どう振る舞うか、細胞フリーシステムにおける転写と翻訳のトレードオフを研究してきた。たくさんの研究がMGaptを使って細胞裂解物でのRNA生産を測定しているよ。

驚くべきことに、PURExpressシステムでのMGaptを使った私たちの研究は、MGaptの読み取りが期待通りに見られなかった理由を説明するような予期せぬ振る舞いを明らかにしたんだ。一般的に、MGaptのようなアプタマーは、似たような分子や同じ分子の異なる形を区別できるんだけど、MGaptは似たような染料にも結合できるから、結果が混乱することがあることがわかった。自由なMGaptは、正しく折りたたまれるRNAの量を減少させることがあり、金属イオンの存在がその反応を変えることもわかっている。

#DTTのMGaptへの影響

この論文では、市販のPUREシステムの化学物質がMGaptを不安定にして、異なる形を取らせ、異なる蛍光レベルを示すことに注目してるんだ。私たちのMGaptの観察をさまざまなPUREシステムで比較して、転写が行われていない時の飽和時間と動的変化に焦点を当てるよ。また、DTTという還元剤がMGaptに与える影響と、それに関する実験データを提供するつもり。

#様々なPUREシステムにおけるMGaptの観察

MGaptの振る舞いの一貫性を確認するために、まず2つのシステムを見てみたんだ。市販のPUREシステムでは、最大のタンパク質生産のための反応時間は2-4時間と示唆されていた。でも、2時間後にMGaptの蛍光は飽和しなかったことに気づいたよ。私たちのラボで作ったシステムでは、PURExpressとOnePot PUREの両方でMGaptの蛍光に明確な違いが見られた。

MGaptの濃度を時間ごとに見たとき、PURExpressではMGaptの蛍光が約6時間でプラトーに達したのに対して、OnePot PUREでは約2時間で飽和した。これは、PURExpressの方がMGaptの生産が長く続いたことを示唆していて、転写が翻訳より長く続くことはないはずなので、不思議だったよ。

#化学成分とMGaptへの影響

違いに気づいた後、両方のシステムの化学成分を調べたんだ。あるシステムには他のシステムにはない複数の塩が見つかったけど、主な違いは使われている還元剤だった-PURExpressではDTT、OnePot PUREではTCEPなんだ。DTTはTCEPのような他の剤と比べて不安定で敏感だと知られている。

これらの化学物質がMGaptに与える影響をさらに評価するために、DTT、TCEP、その他の化学物質の異なる濃度で実験を行った。初期の結果は、TCEPとピロリン酸（PPi）だけがMGaptの蛍光に影響を与えたのに対し、DTTは影響がないように見えたよ。

#環境化学がMGapt蛍光に与える役割

実験を続けていると、MGaptの蛍光が時間とともに一定でなく、MGapt用のRNAだけを使った場合の方が、UTR1-deGFP構造体と組み合わせたときよりも低い蛍光になることがわかった。これは興味深いことで、結果を正規化しても、転写を行っていなくてもMGaptの濃度が時間とともに増加しているのが見えた。

DTTの影響をさらに分析するために、異なるDNA濃度で実験を行った。私たちの発見は、初期のRNA生産が異なる一方で、正規化されたMGapt濃度が時間とともに収束し、再び蛍光がRNA生産自体よりも化学環境に結びついていることを示していたよ。

#DTTによるMGapt蛍光の抑制

私たちの結果は、MGaptがDTT濃度によって影響を受けるさまざまな状態にあることを示唆している。私たちは、DTTがMGaptをどのように変化させ、明るく蛍光を持つ形からあまり蛍光を持たない形に変えるかを示すモデルを構築した。このモデルは、DTTがMGaptの蛍光を抑制し、市販のPUREシステムでのMGaptの振る舞いに影響を与える要因であることを強調しているよ。

私たちはコンピュータプログラムを使ってこのモデルをシミュレーションし、DTTがMGaptとどのように相互作用するかを分析した。蛍光の変化を監視することで、RNA生産を正確に測定する方法をよりよく理解できるようになったんだ。

#実験データでモデルを検証

モデルの信頼性を評価するために、異なるRNA濃度でテストを行い、それを時間とともに監視した。予測されたMGapt濃度は低いRNAレベルで正確であったことが観察され、DTTがMGaptの振る舞いを理解するのに効果的な代理として機能できることを示唆しているよ。

私たちの発見は、市販のPUREシステムの化学的な構成がMGaptの読み取りに大きな影響を与えることを示している。DTTは一部のシステムに存在するが、他のシステムにはないもので、MGaptの蛍光を減少させ、その状態の変化を引き起こす役割を果たす。時間とともにこれが劣化することで、MGaptが再び明るい蛍光を取り戻すかもしれなくて、これがこれらのシステムからのデータの解釈に影響を与えているんだ。

#結論

これらの研究を通じて、MGaptの蛍光特性が使用されるPUREシステムの化学環境に関連していることがわかったよ。特にDTTの存在がMGaptの読み取りを妨げていて、RNA生産の測定に関する誤解を生む可能性があることが示された。私たちのモデルは、異なる条件下でMGaptがどのように振る舞うかを予測する手段を提供していて、細胞フリーシステムにおけるタンパク質合成のより正確な評価への道を開いているんだ。

今後は、他のアプタマーやその蛍光の振る舞いをさらに探求することを勧めていて、これがさまざまなシステムにおけるRNA測定に影響を与える他の要因を特定するのに役立つかもしれない。こうしたアプローチが、研究や産業応用における細胞フリーシステムの使用に関するより良い方法論の開発を助けることになるよ。