Avanzamenti nella microscopia a fluorescenza con il Circulator

La microscopia a fluorescenza è uno strumento molto usato nella ricerca scientifica per studiare strutture microscopiche in cellule vive e materiali. Permette agli scienziati di vedere diverse parti di un campione usando una luce speciale che fa brillare certe molecole. Tuttavia, una delle principali sfide è ottenere il maggior numero possibile di informazioni dettagliate dalle immagini prodotte.

#Aumentare il Contenuto Informativo

Per ottenere informazioni migliori dalle immagini, i ricercatori hanno sviluppato varie tecniche. Un metodo è chiamato ingegneria della funzione di diffusione dei punti (PSF), che cambia come la luce delle molecole fluorescenti appare nelle immagini. Questa tecnica aiuta ad aumentare la chiarezza delle immagini senza limitare quanto di un campione può essere visto o quanto velocemente possono essere scattate le immagini.

Alcuni metodi comuni includono:

• Regolare la forma dei pattern luminosi per vedere più dettagli in aree specifiche.
• Usare attrezzature speciali per catturare diversi colori di luce contemporaneamente.
• Analizzare la luce da singole molecole per raccogliere dettagli specifici su di esse.

Anche se queste tecniche possono fornire immagini migliori, hanno anche dei difetti. Ad esempio, potrebbero richiedere attrezzature complesse o software speciali per analizzare le immagini.

#Sfide con l'Ingegneria PSF

Nonostante i vantaggi, l'ingegneria PSF ha le sue difficoltà. Prima di tutto, quando la PSF può cambiare forma in molti modi, analizzare i dati diventa complicato. I ricercatori devono differenziare attentamente forme simili, il che può essere difficile. Inoltre, l'attrezzatura necessaria per questo tipo di imaging può essere costosa e spesso richiede una personalizzazione precisa per diversi tipi di campioni.

Combinare diverse tecniche PSF può anche essere difficile, poiché ogni metodo può interferire con gli altri. I ricercatori hanno capito che modificare la forma della PSF può limitare quante informazioni possono ottenere dalle loro immagini. Quindi, c'è bisogno di nuove strategie che non comportino modificare direttamente questi pattern luminosi.

#Nuovo Approccio: Il Circolatore

Per superare queste sfide, è stato sviluppato un nuovo dispositivo chiamato Circolatore. Questo strumento permette ai ricercatori di creare più copie del pattern di luce originale senza cambiare la sua forma. Dividendo la luce in diverse copie, ciascuna posizionata in modo diverso, il Circolatore può codificare informazioni importanti sul campione.

Questo nuovo approccio ha diversi vantaggi:

1. Funziona bene su un ampio spettro di colori, mantenendo la chiarezza del pattern di luce originale.
2. Può essere combinato con altri metodi senza causare conflitti.
3. Non richiede software nuovi o complicati per l'analisi.
4. L'accuratezza nel localizzare i target non diminuisce usando questo metodo.

#Come Funziona il Circolatore

Il Circolatore utilizza una configurazione intelligente che include specchi e filtri speciali. La luce proveniente dal campione viene prima collimata (resa parallela) e poi fatta passare attraverso uno splitter di fascio polarizzante e piastre a quarto d'onda. Questa configurazione consente al dispositivo di produrre fino a quattro copie del pattern di luce originale, ciascuna a una posizione e orientamento noti.

L'intensità di ogni copia luminosa dipende dal colore della luce emessa, il che significa che i ricercatori possono facilmente determinare il colore di ogni molecola fluorescente nelle loro immagini. Questo permette anche l'imaging simultaneo di diversi colori, accelerando il processo di raccolta dati complessivo.

#Applicazioni nell'Imaging DNA-PAINT

Il Circolatore è stato testato utilizzando un metodo chiamato DNA-PAINT, che ha permesso l'imaging simultaneo di tre colori diversi in un campione di cellule. I ricercatori sono stati in grado di etichettare proteine specifiche all'interno delle cellule, consentendo di visualizzare strutture importanti come i microtubuli e la clatrina.

La configurazione per questo esperimento ha mostrato che il Circolatore potrebbe accelerare efficacemente l'acquisizione delle immagini mantenendo un ampio campo visivo. Questo significa che i ricercatori non devono aspettare a lungo per raccogliere dati, rendendo i loro esperimenti più efficienti.

#Risoluzione Migliorata con SOFI

Un altro approccio adottato con il Circolatore è chiamato imaging a fluttuazione ottica di super-risoluzione (SOFI). Questo metodo sfrutta il lampeggiamento casuale delle molecole fluorescenti su più immagini. Applicando un'analisi statistica a queste immagini, i ricercatori possono ottenere immagini ad alta risoluzione anche quando ci sono molte molecole presenti.

Usare SOFI con il Circolatore consente un'acquisizione delle immagini più rapida mantenendo alte risoluzioni, rendendola una combinazione potente per gli scienziati che lavorano con campioni densi.

#Tracciamento delle Molecole con il Tracciamento di singole particelle

Per studiare sistemi dinamici, come le interazioni tra cellule vive, è fondamentale tracciare particelle individuali. Anche il Circolatore si è rivelato prezioso per una tecnica chiamata tracciamento di singole particelle (SPT). Questo metodo consente ai ricercatori di monitorare come diverse molecole si muovono e interagiscono nel tempo.

In un esperimento, i ricercatori hanno studiato il movimento di strutture di DNA etichettate in modo speciale che fluttuano su un bilayer lipidico. Usando il Circolatore, possono facilmente identificare molecole colorate diverse e tracciare i loro movimenti in tempo reale.

#Osservare le Interazioni della Membrana Cellulare

I ricercatori hanno anche applicato il Circolatore per osservare le interazioni tra recettori immunitari in cellule vive. Etichettando gli anticorpi IgE con più fluorofori, il Circolatore ha permesso loro di visualizzare come queste molecole si aggregano sulla superficie cellulare.

Il dispositivo ha aiutato a identificare lo stato di diverse molecole prima e dopo uno stimolo specifico, fornendo informazioni su come il sistema immunitario risponde agli allergeni. Questo tipo di analisi è preziosa per capire come funzionano le risposte immunitarie, con implicazioni per allergie e altre condizioni mediche.

#Conclusione

Il Circolatore rappresenta un'importante evoluzione nelle tecniche di microscopia a fluorescenza. Creando più copie del pattern di luce originale, aumenta la quantità di informazioni che i ricercatori possono raccogliere senza complicare il processo. Supporta efficacemente vari metodi di imaging, tra cui SMLM e SOFI, consentendo osservazioni più rapide e dettagliate.

Con potenziali applicazioni nello studio di diversi processi biologici e materiali, il Circolatore apre nuove possibilità nella ricerca scientifica. Andando avanti, può essere adattato per una vasta gamma di compiti di imaging, aumentando ulteriormente l'efficienza e l'efficacia della microscopia a fluorescenza.