Nuove scoperte sui meccanismi dei batteri della tubercolosi

La tubercolosi, o TB, è una malattia infettiva causata da un batterio chiamato Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Questa malattia è un grosso problema in tutto il mondo, uccidendo più di 1,6 milioni di persone ogni anno. Una delle sfide con la TB è che il batterio riesce a nascondersi dal sistema immunitario e può rimanere inattivo in una persona per molti anni. Si stima che circa 1,7 miliardi di persone in tutto il mondo abbiano un'infezione latente di Mtb. Inoltre, il problema è aggravato dall'aumento dei casi in cui i batteri sono resistenti ai farmaci.

#Come Mtb infetta il corpo

Per riuscire a infettare efficacemente una persona, Mtb utilizza vari strumenti, noti come fattori di virulenza, che vengono rilasciati attraverso sistemi speciali all'interno dei batteri. La ricerca ha dimostrato che Mtb può danneggiare determinate strutture cellulari, specificamente la membrana fososomale. Questo processo si basa principalmente su uno dei suoi sistemi di secrezione chiamato ESX-1. Il protagonista responsabile dell'attività dannosa è una proteina chiamata ESAT-6. La comprensione di come funziona ESAT-6 è ancora in fase di sviluppo.

I ricercatori hanno condotto molti studi per capire come ESAT-6 causi danni alla membrana e come questo possa consentire a Mtb di sfuggire dalla sua area di contenimento all'interno delle cellule. Tuttavia, studi precedenti hanno avuto problemi, come la contaminazione con detergenti, che complicano i risultati. Recentemente, i ricercatori hanno iniziato a studiare batteri interi per evitare di utilizzare proteine isolate. Anche se questi esperimenti hanno fornito informazioni preziose, sono complicati da come i diversi componenti del sistema di secrezione lavorano insieme.

#Risultati recenti su ESAT-6

Nonostante il gran lavoro, gli scienziati non hanno ancora capito chiaramente come opera ESAT-6. Questo studio cerca di affrontare la questione conducendo test approfonditi in diverse condizioni. Vengono utilizzate varie tecniche, tra cui un metodo chiamato biolayer interferometry (BLI) per misurare quanto bene ESAT-6 si lega a un'altra proteina chiamata CFP-10. Gli scienziati usano anche tecniche di imaging avanzate per vedere come ESAT-6 forma grandi cluster.

I ricercatori hanno generato un nuovo tipo di Nanobody da alpaca che può legarsi a ESAT-6. Questo nanobody funge da strumento per studiare la funzione di ESAT-6 durante l'infezione da Mtb. Hanno condotto diversi test per capire come funziona questo nanobody nel prevenire la crescita di Mtb all'interno delle cellule infette.

#Produzione delle proteine ESAT-6 e CFP-10

Per studiare ESAT-6 e CFP-10, il team ha creato queste proteine usando batteri. Hanno prodotto le proteine in E. coli, un tipo comune di batterio usato nei laboratori. Hanno controllato la sequenza di DNA usata per creare le proteine e confermato di avere la sequenza giusta. Poi hanno purificato le proteine, assicurandosi che fossero di buona qualità per ulteriori test. Queste proteine sono essenziali per indagare come ESAT-6 interagisce con CFP-10.

#Validazione della formazione del dimero

Uno degli obiettivi principali era vedere se ESAT-6 e CFP-10 potevano formare una coppia stabile, conosciuta come dimero. I ricercatori hanno testato diverse miscele di queste proteine per vedere come si comportavano in diverse condizioni. Hanno utilizzato una tecnica chiamata native-PAGE per analizzare le miscele, confermando che ESAT-6 e CFP-10 possono effettivamente formare un complesso.

#Test dell'attività emolitica

Un altro aspetto importante della ricerca era testare se ESAT-6 potesse causare Emolisi, ovvero la rottura dei globuli rossi. Studi passati avevano risultati misti, ma i ricercatori hanno scoperto che la loro forma di ESAT-6 non causava emolisi da sola. Tuttavia, hanno trovato che alcuni batteri erano in grado di distruggere i globuli rossi quando venivano a diretto contatto con essi. Questo ha sollevato domande su come si comporta Mtb rispetto al suo parente stretto, Mycobacterium marinum (Mm).

#Misurazione della forza di legame

Per comprendere la forza delle interazioni tra ESAT-6 e CFP-10, i ricercatori hanno condotto esperimenti usando BLI. Hanno scoperto che mentre ESAT-6 interagisce fortemente con CFP-10, ha anche la capacità di associarsi a se stesso. Questa auto-associazione si verifica in modo più significativo in condizioni acide, il che corrisponde a ciò che si trova all'interno delle cellule infette. I risultati suggeriscono che le condizioni acide favoriscono la formazione di complessi più grandi di ESAT-6, il che potrebbe avere implicazioni per la sua funzione.

#Formazione di grandi complessi di ESAT-6

I ricercatori hanno notato che a livelli di pH più bassi, ESAT-6 formava strutture più grandi rispetto a condizioni neutre. Hanno condotto test aggiuntivi per vedere quanto tempo impiegasse a formarsi questi complessi più grandi. Hanno osservato che questi complessi diventavano più visibili quando ESAT-6 era a un pH di 4,5, rispetto a quando era a un pH di 7,5. Questo ha indicato che l'ambiente acido all'interno di alcune cellule potrebbe innescare cambiamenti significativi in ESAT-6.

#Osservare i complessi di ESAT-6

Utilizzando tecniche di imaging, i ricercatori sono stati in grado di visualizzare questi grandi complessi di ESAT-6. Hanno mescolato diverse forme di ESAT-6 e le hanno osservate sotto un microscopio. Le immagini hanno rivelato strutture intricate che non erano presenti in condizioni neutre. Questo ha suggerito che l'ambiente influisce davvero su come si comporta ESAT-6.

#Analisi della stechiometria

Per indagare ulteriormente la natura dei complessi di ESAT-6, il team ha impiegato un metodo che misura il peso molecolare dei composti mentre passano attraverso una colonna. A pH neutro, hanno scoperto che ESAT-6 formava dimeri, mentre a pH acido è stata notata la presenza di complessi più grandi. Questo ha fornito informazioni su come ESAT-6 interagisce in diverse condizioni.

#Sviluppo di un nanobody contro ESAT-6

Lo studio ha incluso anche la generazione di un nanobody che targetizza specificamente ESAT-6. Questo nuovo strumento può aiutare i ricercatori a osservare come ESAT-6 funzioni durante l'infezione. Lo studio ha rivelato che questo nanobody potrebbe legarsi a ESAT-6 e fornire informazioni utili sul suo ruolo nelle infezioni da Mtb.

#Test funzionali con il nanobody

I ricercatori hanno condotto test per vedere se il nuovo nanobody potesse ridurre la crescita di Mtb nelle cellule. Hanno usato approcci diversi, tra cui l'osservazione di cellule infette con una ceppo modificato di Mtb che brillava al buio. I risultati hanno mostrato che le cellule trattate con il nanobody avevano una riduzione significativa nella crescita dei batteri rispetto a quelle trattate con un controllo.

#Conclusioni

Questo studio evidenzia diversi risultati importanti su ESAT-6. In primo luogo, stabilisce che ESAT-6 può formare rapidamente grandi complessi in ambienti acidi. In secondo luogo, in assenza di CFP-10, ESAT-6 rimane dimero in condizioni neutre. Infine, il nuovo nanobody sviluppato, E11rv, mostra promesse nell'inibire la crescita di Mtb all'interno delle cellule.

I ricercatori hanno notato alcune scoperte sorprendenti riguardo alle informazioni incomplete sulla sequenza degli aminoacidi di uno dei costrutti di ESAT-6 comunemente usati. Tuttavia, i loro dati non hanno indicato differenze pratiche tra costrutti con diversi tag.

In generale, indagare la funzione dei fattori di virulenza di Mtb presenta sfide a causa della difficile natura del gestire i batteri in un sistema vivente. I risultati di questa ricerca potrebbero fornire nuovi metodi per capire come Mtb interagisce con le cellule ospiti, potenzialmente portando a nuovi approcci nel trattamento e nella gestione delle infezioni da TB.