La nuova tecnologia SDDWP-sSMLM migliora l'imaging molecolare

La Microscopia a Localizzazione di Singole Molecole (SMLM) è una tecnologia di imaging avanzata usata in tanti campi scientifici. Si fa notare perché offre un modo economico per ottenere immagini super dettagliate rispetto ad altre tecniche come la microscopia a illuminazione strutturata (SIM) o la deplezione da emissione stimolata (STED). Il principale vantaggio della SMLM è che si basa principalmente su normali microscopi a fluorescenza insieme a software speciali per scattare e analizzare le immagini. Questa facilità d’uso ha reso la SMLM molto popolare tra i ricercatori che vogliono vedere strutture minuscole a livello molecolare.

Col tempo, gli scienziati hanno cercato modi per ottenere risultati ancora migliori dalla SMLM. Un’area importante dove vogliono migliorare è l’imaging multiplo, che significa catturare immagini con più colori contemporaneamente. Anche se sono state sviluppate alcune tecniche per separare diverse molecole colorate, possono farlo solo con un numero limitato di colori alla volta. C’è anche un metodo in cui i diversi colori vengono attivati uno dopo l’altro, ma questo richiede molto tempo.

#Avanzamenti nella SMLM

Per affrontare le limitazioni dei metodi SMLM tradizionali, è stato introdotto un nuovo approccio chiamato SMLM spettroscopica (sSMLM). Questo metodo migliora la SMLM normale aggiungendo una lente speciale, come una rete di diffrazione o un prisma. Questi elementi aiutano a catturare non solo la posizione delle singole molecole, ma anche le loro proprietà di colore contemporaneamente. Analizzando lo spettro completo della luce emessa dalle molecole, la sSMLM può teoricamente usare molti colori insieme, rendendo possibile creare immagini più complesse senza sacrificare la qualità.

Tuttavia, le versioni precedenti della sSMLM avevano alcuni svantaggi. Ad esempio, il modo in cui separavano i colori spesso diminuiva la precisione delle immagini. Per superare ciò, è stato creato un nuovo design chiamato sSMLM simmetricamente disperso (SDsSMLM). Questo design utilizza un arrangiamento speciale di lenti per garantire che i fotoni siano usati in modo più efficace, portando a una migliore qualità dell’immagine.

Un altro avanzamento è arrivato con l’introduzione di un prisma a doppio cuneo (DWP). Questo nuovo design consente un utilizzo della luce ancora migliore, risultando in una precisione migliorata sia nelle direzioni laterali che assiali. Con questi sviluppi, i ricercatori sono ora in grado di ottenere immagini più accurate e dettagliate senza la necessità di configurazioni complicate.

#Nuova tecnologia SDDWP-sSMLM

L’ultima versione di questa tecnologia di imaging si chiama SMLM con prisma a doppio cuneo simmetricamente disperso (SDDWP-sSMLM). Questa tecnologia utilizza due DWP, il che significa che può catturare la luce sia nelle direzioni spettrali positive che negative. Facendo ciò, massimizza la quantità di luce raccolta per l’analisi. Questo è particolarmente utile quando si lavora con normali microscopi a fluorescenza, poiché la nuova configurazione può essere facilmente attaccata e non richiede aggiustamenti complessi.

La semplicità di questa nuova tecnologia la rende ampiamente accessibile, consentendo a molti ricercatori di beneficiare delle capacità di imaging di alta qualità.

#Panoramica del processo SDDWP-sSMLM

#Preparazione dei campioni per l'imaging

Per testare le capacità della SDDWP-sSMLM, gli scienziati devono preparare campioni specifici. Per la calibrazione, spesso utilizzano una matrice di nanohole personalizzata. Questa matrice è creata depositando uno strato sottile di alluminio su una superficie di vetro e poi creando piccoli fori usando la fresatura con fasci di ioni focalizzati. Questo serve come riferimento per controllare l’accuratezza del sistema di imaging.

Oltre ai target di calibrazione, gli scienziati preparano anche campioni di microsfere fluorescenti per convalidare il sistema di imaging. Le microsfere vengono diluite e posizionate su un vetrino specializzato per corrispondere alle condizioni dei veri campioni biologici che vogliono studiare.

Per i campioni biologici, i ricercatori utilizzano spesso Coloranti fluorescenti per colpire strutture specifiche all'interno delle cellule. Ad esempio, potrebbero usare coloranti diversi per visualizzare i mitocondri, i microtubuli e altre parti importanti della cellula.

#Configurazione dell'imaging

La configurazione SDDWP-sSMLM si basa su sistemi SMLM precedenti. Utilizza un microscopio invertito con una lente ad alta potenza per illuminare i campioni con un laser specifico. La luce emessa dal campione viene quindi catturata attraverso filtri speciali, il che consente un percorso di imaging chiaro per analizzare la fluorescenza emessa dai campioni.

La configurazione per l'imaging può essere configurata per imaging bidimensionale (2D) e tridimensionale (3D). Nella configurazione 2D, il percorso della luce è progettato per garantire che le immagini siano correttamente a fuoco su una camera scientifica. Nella disposizione 3D, vengono catturate due immagini separate a angoli leggermente diversi, fornendo informazioni di profondità sui campioni.

#Procedura di calibrazione

Prima di iniziare il processo di imaging, la calibrazione è essenziale. Prima, i ricercatori utilizzano la matrice di nanohole per abbinare le posizioni delle immagini catturate nel sistema. Questo aiuta a garantire che le misurazioni prese dalle immagini siano accurate. Effettuano diversi test con vari filtri luminosi per valutare quanto bene il sistema possa distinguere tra diverse lunghezze d'onda della luce.

Successivamente, per prepararsi all'imaging dei campioni biologici, prendono misurazioni di microsfere fluorescenti a diverse profondità. Questo consente loro di comprendere quanto bene il sistema può catturare immagini a varie posizioni assiali.

#Tecniche di Elaborazione delle immagini

Una volta completato l’imaging, gli scienziati devono analizzare i dati raccolti. Utilizzano software specializzati per identificare singole molecole o i punti creati dalla matrice di nanohole. Il software aiuta a determinare informazioni importanti come la dimensione e la posizione di questi punti.

Nel caso dell’imaging 3D, il software aiuta anche a inferire informazioni sulla profondità e a distinguere tra diversi marcatori fluorescenti. I dati provenienti da più fotogrammi possono essere elaborati insieme per fornire un quadro chiaro del campione studiato.

#Risultati e scoperte

Per valutare l'efficacia della SDDWP-sSMLM, i ricercatori confrontano i risultati con metodi precedenti. Verificano quanto bene il nuovo sistema si comporta in termini di precisione laterale, che si riferisce a quanto accuratamente il sistema può localizzare le molecole nel piano del campione.

La nuova tecnologia SDDWP-sSMLM mostra miglioramenti significativi nella precisione con cui può localizzare queste molecole rispetto ai metodi più vecchi. Ad esempio, a un certo numero di fotoni emessi, la SDDWP-sSMLM può raggiungere una precisione laterale fino al 27% migliore rispetto ai sistemi predecessori.

Gli stessi miglioramenti sono notati anche per la precisione spettrale, che misura quanto accuratamente il sistema può identificare i colori della luce emessi dalle diverse molecole. L'aumento nella precisione spettrale è abbastanza sostanziale, raggiungendo anche cifre che consentono un’identificazione più chiara di colori che si sovrappongono.

Inoltre, la capacità del sistema di eseguire imaging 3D fornisce informazioni di profondità che non erano così accurate nelle versioni precedenti. I miglioramenti sia nella precisione assiale che laterale rendono la SDDWP-sSMLM uno strumento prezioso per studiare strutture biologiche complesse.

#Applicazioni di imaging cellulare

Per dimostrare l'applicazione pratica di questa nuova tecnologia di imaging, i ricercatori hanno utilizzato la SDDWP-sSMLM per visualizzare cellule HeLa, comunemente usate negli studi di laboratorio. Le cellule sono state trattate con coloranti specifici che colpiscono diverse strutture all'interno della cellula.

I risultati hanno mostrato che il sistema di imaging poteva visualizzare efficacemente le complesse relazioni tra mitocondri, microtubuli e altri componenti cellulari. La profondità delle informazioni catturate ha consentito una comprensione più sfumata di come queste strutture interagiscono all'interno delle cellule vive.

Oltre a mostrare le varie strutture, il software ha fornito una ricostruzione codificata in profondità delle cellule. Ciò significa che i ricercatori possono visualizzare la posizione di diversi componenti all'interno dello spazio tridimensionale delle cellule, migliorando la loro comprensione dei meccanismi cellulari.

#Conclusione

Questo avanzamento nella tecnologia SMLM, specificamente con la SDDWP-sSMLM, ha aperto nuove possibilità per i ricercatori interessati a studiare le interazioni molecolari. L'alta precisione spaziale e spettrale raggiunta con questa tecnologia dovrebbe facilitare una migliore comprensione dei processi biologici complessi.

Con la capacità di catturare immagini dettagliate di cellule vive e delle loro intricate strutture, la SDDWP-sSMLM è destinata a diventare uno strumento innovativo nella ricerca scientifica. Man mano che più ricercatori adottano questa tecnologia, porterà probabilmente a nuove scoperte in vari campi, dalla biologia e medicina alla scienza dei materiali.

I ricercatori sono entusiasti delle implicazioni di queste scoperte, poiché combinano imaging ad alta risoluzione con facilità d'uso. Il futuro dell’imaging cellulare sembra luminoso, con la SDDWP-sSMLM che apre la strada a nuove intuizioni nel mondo delle interazioni molecolari.