Avanzamenti nella proteomica mirata usando la spettrometria di massa

La spettrometria di massa (MS) è una tecnica usata per analizzare miscele complesse di proteine in campioni biologici. Offre un modo affidabile per misurare la quantità di proteine specifiche senza fare affidamento su metodi tradizionali come gli immunoassay. Un modo comune per usare la spettrometria di massa per questo scopo è attraverso un metodo noto come proteomica mirata, in particolare con una tecnica chiamata monitoring di reazione selezionata (SRM).

#Come Funziona la Proteomica Mirata

Nella proteomica mirata, gli scienziati prima scompongono le miscele di proteine in pezzi più piccoli chiamati peptidi. Ogni peptide può fungere da sostituto per la proteina più grande da cui proviene. Per misurare questi peptidi in modo accurato, gli scienziati usano un tipo di spettrometro di massa chiamato spettrometro di massa a triplo quadrupole. Questo dispositivo aiuta a selezionare coppie di ioni specifici, necessari per misurare i peptidi. Questo metodo è noto per la sua accuratezza e coerenza quando si misurano i livelli di peptidi in campioni complessi.

Tuttavia, una sfida sorge quando si tratta di scegliere i giusti peptidi da utilizzare per la misurazione. Le buone scelte di peptidi devono:

1. Riflettere accuratamente la quantità di forme specifiche di proteine.
2. Funzionare bene nel tipo specifico di campione testato.
3. Separarsi bene durante il processo di misurazione.

#Tecniche di Selezione dei Peptidi

Per selezionare i migliori peptidi, i ricercatori spesso guardano ai dati esistenti nella letteratura e nei database o conducono i propri esperimenti. Questo processo è complicato da fattori come come viene preparato il campione e come viene effettuata la misurazione. Ad esempio, molti studi esistenti usano l'acquisizione dipendente dai dati (DDA), che raccoglie dati in base a determinati criteri che non sempre possono risultare efficaci per misurazioni mirate.

Un approccio alternativo prevede l'uso di SRM per analizzare proteine già note. In questo processo, le proteine vengono accuratamente purificate e scomposte in peptidi, che vengono poi misurati separatamente per selezionare i migliori per l'analisi quantitativa. Anche se questo può migliorare l'accuratezza della selezione dei peptidi, determinare quanto bene i peptidi originali performano in un campione specifico rimane una sfida.

#Acquisizione indipendente dai dati (DIA)

L'acquisizione indipendente dai dati (DIA) è un'altra strategia che fornisce un modo più organizzato per analizzare i peptidi. La ricerca mostra che i metodi predittivi addestrati sui dati DIA spesso fanno meglio di quelli basati su DDA quando si selezionano peptidi per analisi mirate.

Nei studi precedenti, è stato sviluppato un metodo utilizzando più iniezioni per coprire l'intervallo di massa dei peptidi comuni con finestre di isolamento ristrette. Questa strategia può raccogliere dati direttamente dai campioni biologici, tenendo conto della composizione del campione.

Utilizzando una libreria frazionata in fase gassosa ottenuta da campioni biologici, i ricercatori possono selezionare efficientemente peptidi per SRM. Le informazioni sui tempi di ritenzione e sulle transizioni vengono generate durante la creazione della libreria, rendendo il processo di selezione più fluido.

#Campioni di Liquido cerebrospinale

Lo studio coinvolge l'uso di campioni di liquido cerebrospinale (CSF) raccolti da individui diagnosticati con malattia di Alzheimer o Parkinson, insieme a soggetti di controllo sani. I campioni sono stati prelevati secondo rigorose linee guida e conservati per i test. I campioni raccolti sono stati mescolati con cura per creare un campione di riferimento per lo sviluppo del metodo.

#Preparazione dei Campioni di Liquido Cerebrospinale

Per preparare i campioni di CSF per l'analisi, sono stati prima diluiti e riscaldati per denaturare le proteine. Questo processo ha coinvolto la riduzione, l'alkilazione e la digestione delle proteine. I peptidi risultanti sono stati poi purificati per rimuovere eventuali impurità, permettendo misurazioni accurate.

#Spettrometria di Massa DIA e Elaborazione

I peptidi preparati sono stati separati utilizzando un impianto speciale di cromatografia liquida, seguito dalla raccolta dei dati tramite DIA. Questo ha comportato più iniezioni per garantire una copertura completa dell'intervallo di massa dei peptidi.

I dati della spettrometria di massa sono stati elaborati per identificare i peptidi e le loro caratteristiche specifiche. Le informazioni sono state organizzate in un modo che ha reso facile accedervi durante la selezione dei peptidi per l'analisi mirata.

#Monitoraggio di Reazione Selezionata nell'Acquisizione e Elaborazione

Utilizzando uno spettrometro di massa a triplo quadrupole, sono stati raccolti dati mirati. Ogni campione ha subito una separazione accurata per misurare adeguatamente i peptidi. Il processo ha coinvolto vari passaggi per garantire una rilevazione e quantificazione accurate dei peptidi.

I dati proteomici mirati sono stati analizzati utilizzando software che ha aiutato a sommare le intensità di picco dei peptidi monitorati. La normalizzazione dei dati e l'analisi statistica hanno garantito risultati affidabili.

#Risultati della Rilevazione dei Peptidi

Dal campione analizzato, è stato rilevato un numero significativo di peptidi corrispondenti a varie proteine. Questi potenziali target SRM sono stati valutati in base alle loro transizioni co-eluenti e alle interferenze. L'analisi ha rivelato che molti peptidi erano candidati affidabili per studi futuri.

#Selezione dei Peptidi Basata sulle Prestazioni

Valutando la stabilità e l'intensità di ciascun peptide, i ricercatori potrebbero filtrare quelli che probabilmente non avrebbero performato bene negli assay SRM. Questo processo di filtraggio si è concentrato sulla selezione di peptidi che hanno dimostrato buone prestazioni nelle misurazioni DIA precedenti.

#Sviluppo di un Workflow per Assay Mirati

Lo studio delinea un approccio sistematico per creare assay mirati. Un campione pool di CSF di pazienti è stato utilizzato per eseguire diversi esperimenti DIA. Ogni esperimento ha prodotto dati preziosi sulla rilevazione e sulle prestazioni dei peptidi.

I peptidi selezionati hanno subito un processo di classificazione per determinare la loro idoneità per l'analisi mirata. Questo flusso di lavoro efficiente ha permesso ai ricercatori di creare un assay mirato con tempo e risorse minimi.

#Confronto dei Risultati con Assay Sviluppati in Precedenza

Per convalidare il metodo, il nuovo assay sviluppato è stato confrontato con assay esistenti per la malattia di Alzheimer. I risultati hanno mostrato che i peptidi selezionati hanno performato in modo simile, dimostrando l'efficacia del nuovo processo di selezione dei peptidi.

#Generazione di Assay Aggiuntivi Utilizzando Dati DIA

Uno dei vantaggi significativi dell'utilizzo dei dati DIA è la possibilità di creare più assay per diverse proteine dallo stesso set di dati. In questo caso, i ricercatori hanno generato un assay separato per le proteine legate al dolore cronico, mostrando la versatilità delle informazioni raccolte.

#Uso Efficiente dei Metodi DIA

L'avvento dei metodi DIA ha portato a una grande quantità di dati che possono essere sfruttati per sviluppare assay mirati. Questa conoscenza accumulata consente ai ricercatori di estrarre facilmente informazioni rilevanti sui peptidi, rendendo lo sviluppo degli assay meno laborioso.

#Conclusione

Il flusso di lavoro presentato per generare assay SRM mirati è efficiente, richiedendo solo pochi giorni di tempo strumentale e uno sforzo minimo da parte dei tecnici. È capace di selezionare peptidi con alta intensità e buone prestazioni, aprendo la strada per analisi efficaci in vari contesti biologici.

Man mano che più dati diventano disponibili dagli esperimenti DIA, migliorerà la nostra capacità di creare assay robusti per una vasta gamma di applicazioni, aiutando infine nella comprensione di diverse malattie e processi biologici.