Sviluppi nella tomografia crio-elettronica per l'imaging delle proteine

La crio-tomografia elettronica (cryoET) è una tecnica che aiuta gli scienziati a vedere la struttura delle proteine con dettagli super elevati dentro le cellule. Però, questo metodo ha delle sfide. Per esempio, i campioni devono essere più sottili della dimensione tipica di una cellula e può essere difficile rilevare proteine più piccole in ambienti affollati. Queste limitazioni significano che i metodi attuali non funzionano per un gran numero di proteine negli esseri umani.

Per risolvere questi problemi, i ricercatori hanno sviluppato diverse tecniche, come la fresatura a ionizzazione focale a crio (FIB), che crea campioni molto sottili da cellule e tessuti. Anche se è efficace, questo metodo è lento e complicato. Inoltre, fatica a ottenere immagini chiare della membrana esterna della cellula. Quindi, c'è bisogno di metodi più veloci e semplici per preparare i campioni.

#Nuovi Metodi per la Preparazione dei Campioni

Una tecnica promettente coinvolge un processo chiamato "unroofing" cellulare, che è più veloce ed economico. Questo metodo è generalmente usato in altri tipi di microscopia e aiuta a isolare le membrane esterne delle cellule con un impatto minimo. Tuttavia, produrre queste membrane su griglie fragili per cryoET è comunque complicato e non è stato testato su larga scala.

Un'altra sfida significativa in cryoET è identificare le proteine. Una possibile soluzione è usare etichette speciali che siano visibili sotto la microscopia elettronica. Esempi includono le incapsuline e le ferritine, che possono essere attaccate a proteine all'interno di cellule vive. Però, il processo di etichettatura può richiedere molto tempo e potrebbe influenzare il comportamento naturale delle proteine.

In questo lavoro, i ricercatori presentano un nuovo flusso di lavoro che utilizza l'unroofing cellulare per produrre campioni preziosi per cryoET. Questo processo consente una migliore imaging delle membrane esterne delle cellule e fornisce maggiori dettagli nello studio delle proteine.

#Isolamento delle Membrane su Griglie

I ricercatori volevano isolare le membrane basali e apicali (superiori) delle cellule in coltura per cryoET. Per fare questo per le membrane basali, hanno preparato griglie speciali per far crescere le cellule. Le cellule sono state poi coltivate per un giorno. Dopo, un buffer speciale è stato spruzzato sulla griglia per lavare via le parti superiori delle cellule, lasciando solo le membrane basali.

Per isolare le membrane apicali, i ricercatori hanno prima fatto crescere le cellule su coprioggetti di vetro. Poi hanno trasferito le cellule sulle griglie toccando leggermente la griglia sul coprioggetto. Dopo il trasferimento, le parti basali delle cellule sono state lavate via per lasciare solo le membrane apicali. Le membrane isolate possono quindi essere utilizzate per ulteriori imaging e analisi.

#Osservazione delle Strutture Membranose

Dopo aver preparato le membrane isolate, i ricercatori hanno usato la microscopia elettronica a replica in platino (PREM) per studiare l'organizzazione delle strutture cellulari sulle membrane. I risultati hanno mostrato differenze nell'organizzazione tra le membrane basali e apicali. Per esempio, le membrane apicali mostravano molte piccole protrusioni chiamate filipodia.

Entrambi i tipi di membrane contenevano varie strutture come filamenti di actina e aree rivestite di clatrina. È stata condotta un'analisi dettagliata per categorizzare le forme delle strutture di clatrina osservate. I ricercatori hanno scoperto che più strutture di clatrina piatte erano presenti sulle membrane basali rispetto a quelle apicali. Questi risultati suggeriscono che la superficie della griglia influisce su come le proteine e gli organelli sono distribuiti sulle membrane.

#Spessore del Campione per CryoET

Dopo il processo di unroofing, i ricercatori hanno esplorato lo spessore dei campioni di membrana preparati per controllarne l'idoneità per cryoET. Le membrane sono state rapidamente congelate e poi esaminate al microscopio. I ricercatori hanno scoperto che lo spessore medio dei campioni era abbastanza simile a quelli prodotti dalla fresatura FIB, dimostrando che l'unroofing può produrre campioni altrettanto buoni per l'imaging.

#Mantenimento dell'Informazione ad Alta Risoluzione

I ricercatori hanno anche esaminato i ribosomi, che sono importanti per la sintesi delle proteine, nei campioni unroofed. Hanno condotto uno studio per vedere se i dettagli ad alta risoluzione dei ribosomi erano preservati nei campioni. Analizzando i ribosomi tramite l'averaging di subtomogrammi, hanno trovato che anche nei campioni unroofed, riuscivano a vedere chiaramente i ribosomi, indicando che le strutture erano ben preservate.

#Tecniche di Imaging Correlativo

Per localizzare le proteine nei campioni preparati, i ricercatori hanno usato una combinazione di microscopia a fluorescenza e microscopia elettronica. Hanno impiegato un marcatore fluorescenti che avrebbe messo in evidenza una proteina specifica, in questo caso, una proteina coinvolta nell'endocitosi mediata dalla clatrina. Hanno poi condotto una serie di passi di imaging per individuare dove si trovava questa proteina sulle membrane.

Usando questo metodo, hanno identificato con successo aree di endocitosi arrestata, il che significa che potevano osservare dove il processo delle cellule che prendono sostanze si era fermato. Questo metodo consente una migliore comprensione della dinamica delle proteine durante i processi cellulari.

#Identificazione di Proteine Specifiche

Per identificare determinate proteine all'interno dei tomogrammi, i ricercatori hanno testato un nuovo sistema di etichettatura chiamato FerriTag. Questo sistema di etichettatura consente una veloce ed efficiente etichettatura delle proteine nei campioni. Dopo aver confermato l'efficacia di questa etichettatura in cellule vive, i ricercatori hanno proceduto a usarla per l'imaging cryoET.

Quando applicato a membrane isolate, il FerriTag è stato osservato attorno alle strutture di clatrina, distinguendo chiaramente dove si trovava la proteina etichettata. I ricercatori hanno trovato che il FerriTag poteva essere usato in modo affidabile per studiare proteine di interesse, mostrando i benefici di questo nuovo sistema di etichettatura.

#Conclusione

In sintesi, questo lavoro evidenzia l'efficacia della combinazione delle tecniche di unroofing cellulare con cryoET e metodi di etichettatura per migliorare l'imaging delle proteine alla membrana plasmatica. I ricercatori hanno dimostrato che i campioni unroofed forniscono uno spessore e una qualità adeguati per l'imaging ad alta risoluzione. I nuovi metodi consentono un'identificazione e un'analisi accurate delle proteine all'interno dell'ambiente cellulare, aprendo la strada a una migliore comprensione nella biologia cellulare.

#Direzioni Future

I risultati di questo studio sono destinati ad avere importanti implicazioni per la ricerca futura in biologia cellulare e campi correlati. Rendendo cryoET più efficiente e accessibile, i ricercatori possono studiare molti processi cellulari importanti e ottenere approfondimenti più profondi sulle interazioni e le funzioni delle proteine.

#Importanza della Ricerca Continua

Man mano che vengono sviluppate tecniche di imaging più avanzate, è essenziale continuare a esplorare e perfezionare i metodi per la preparazione dei campioni e l'analisi dei dati. L'integrazione di diverse modalità di imaging, come la microscopia ottica ed elettronica, può fornire una visione completa delle strutture e delle funzioni cellulari.

#Applicazioni Più Ampie

Le potenziali applicazioni di queste tecniche vanno oltre la ricerca fondamentale. Possono avere un ruolo critico nella comprensione dei meccanismi di malattia, guidare lo sviluppo di farmaci e migliorare le strategie terapeutiche. Permettendo agli scienziati di osservare le proteine nel loro ambiente naturale, questi metodi forniscono strumenti preziosi per svelare le complessità del comportamento e delle interazioni cellulari.

#Enfasi sull'Accessibilità

Infine, aumentare l'accessibilità a questi metodi di imaging avanzati sarà cruciale per guidare la scoperta scientifica. Lo sviluppo continuo di tecniche di preparazione dei campioni rapide, semplici ed efficienti permetterà a un numero più ampio di ricercatori di utilizzare cryoET e tecnologie simili nel loro lavoro.

Nel complesso, i metodi e i risultati discutiti qui contribuiscono a una crescente comprensione dei processi cellulari, sottolineando l'importanza degli approcci interdisciplinari nel far progredire la ricerca biologica.