Nuove scoperte sulla resistenza antimicrobica e sul T6SS

La resistenza antimicrobica (AMR) è un grosso problema di salute globale. Nel 2019, è stata legata a quasi 5 milioni di morti. Se non troviamo nuove soluzioni, le previsioni dicono che l'AMR potrebbe causare fino a 10 milioni di morti all'anno entro il 2050. Per combattere questa questione, è super importante creare nuovi tipi di antimicrobici, ma è davvero una sfida.

Uno degli obiettivi principali per questi nuovi antimicrobici è la parete cellulare dei batteri. Questa parete è per lo più composta da una sostanza chiamata Peptidoglicano (PG), essenziale per la sopravvivenza dei batteri. Trovare nuove piccole molecole che possano inibire il PG sta diventando sempre più difficile, perché ci sono meno opzioni disponibili e la resistenza sta aumentando. Tuttavia, ci sono enzimi naturali creati dai batteri che possono degradare il PG, e questi non vengono utilizzati al meglio nei trattamenti contro l'AMR.

#Il Sistema di Secrezione di Tipo VI: Un'arma batterica

Nei batteri Gram-negativi, c'è uno strumento chiamato sistema di secrezione di tipo VI (T6SS). Questo sistema permette ai batteri di iniettare enzimi che rompono il PG e altre tossine direttamente nei microbi vicini e persino nelle cellule di lievito e mammiferi. La struttura del T6SS è complessa, composta da più componenti. Il sistema ha una struttura tubolare e una base che aiuta a funzionare in modo efficace.

Quando il T6SS viene attivato, può rilasciare un tubo simile a una lancia che può penetrare le cellule dei batteri vicini. Tuttavia, il danno causato da questo sistema è principalmente dovuto agli enzimi e alle tossine che rilascia piuttosto che alla penetrazione fisica stessa. Sono state rilevate molte proteine diverse chiamate effettori nei batteri Gram-negativi, e alcune di esse possono danneggiare la parete cellulare, le membrane e persino il DNA.

#Blocchi costruttivi delle pareti cellulari dei batteri

La struttura del PG include unità ripetute composte da due zuccheri, N-acetilglucosamina (NAG) e acido N-acetilmuramico (NAM). Ogni NAM ha un piccolo peptide attaccato ad essa. Questi peptidi sono interconnessi, creando una rete che circonda le cellule batteriche. Gli effettori del T6SS che prendono di mira il PG possono essere raggruppati in due principali categorie: quelli che tagliano le catene peptidiche (amidasi/endopeptidasi) e quelli che tagliano le catene zuccherine (glicoside idrolasi).

Un enzima unico, Tse4, trovato in Acinetobacter baumannii, può fare entrambe le azioni, ma è raro trovare proteine bifunzionali.

#Aeromonas dhakensis: una minaccia per la salute

Un patogeno comune che si trova nell'acqua è Aeromonas dhakensis, che può infettare sia pesci che umani, causando gravi problemi di salute. Un particolare ceppo di questo batterio ha un T6SS funzionante che può rilasciare tre proteine antimicrobiche conosciute. Una di queste proteine, TseP, ha dimostrato di aiutare il T6SS a funzionare meglio ripristinando il flusso di altre proteine quando è assente. TseP ha due parti: una che svolge la funzione di un Lisozima e un'altra parte il cui ruolo non è ancora chiaro.

Recenti ricerche hanno mostrato che la parte poco chiara di TseP, chiamata TsePN, è in grado di tagliare il legame peptidico che collega NAM e L-Ala, agendo come un amidasi. Sia TsePN che la parte simile al lisozima possono essere secretate dal T6SS, ma TsePN è cruciale perché può compensare i problemi del T6SS.

#Struttura e funzione di TseP

I ricercatori hanno scoperto che TsePN ha un contenuto di GC più alto rispetto a TsePC, e proteine simili esistono in modo indipendente in varie specie, suggerendo un evento di fusione evolutiva. TseP può anche essere ingegnerizzato per distruggere cellule resistenti di Bacillus subtilis Gram-positivo, dando al T6SS la capacità di uccidere queste cellule senza contatto diretto. Questo lavoro identifica una nuova classe di proteine bifunzionali e fornisce spunti su come si siano evolute nel tempo.

#Secrezione indipendente dei domini di TseP

Per capire le parti importanti di TseP che aiutano nella sua secrezione, gli scienziati hanno creato due versioni più piccole di TseP, chiamate TsePN e TsePC, e le hanno testate in un ceppo privo di altri effettori. I risultati mostrano che sia TseP che TsePN possono aiutare a ripristinare la secrezione di una proteina chiamata Hcp, mentre TsePC no. Questo suggerisce che TsePN svolge un ruolo strutturale chiave.

#Ruolo di TseP nell'assemblaggio del T6SS

Le immagini in time-lapse hanno anche confermato che solo TseP e TsePN potevano aiutare nell'assemblaggio del T6SS, indicando che la parte N-terminale di TseP è importante per la struttura del T6SS.

Ulteriori test hanno mostrato che TsePN veniva secreto mentre TsePC no. Questo ha sollevato interrogativi sul fatto che il mancato rilascio di TsePC fosse dovuto a difetti nel T6SS. In esperimenti aggiuntivi, TsePC è stato secreto in piccole quantità anche in ceppi mutanti, suggerendo che può essere secreto ma meno efficacemente.

L'analisi pull-down ha confermato che sia TsePN che TsePC interagiscono con una proteina chiamata VgrG2, che aiuta nel loro rilascio, evidenziando che entrambe possono essere gestite in modo indipendente dal T6SS.

#TsePN: un'ampidasi speciale

Analizzando i prodotti formati quando TseP agisce sul PG, i ricercatori hanno trovato due principali tipi di prodotti, suggerendo un'attività amidasi. TsePN è stato dimostrato responsabile di questa attività amidasi poiché altre versioni non potevano ottenerla.

La struttura di TsePN mostra che richiede ioni di zinco per la sua funzione. Quando lo zinco veniva rimosso o quando venivano introdotte mutazioni che influenzavano il legame con lo zinco, l'attività amidasi di TsePN era notevolmente ridotta.

I test hanno anche mostrato che una proteina di immunità chiamata TsiP può inibire sia l'attività amidasi che quella del lisozima di TseP, TsePN e TsePC. Questo suggerisce che TsiP può neutralizzare gli effetti nocivi di queste proteine.

#Ruolo di TsePN nel T6SS e nella funzione del lisozima

Per controllare se la funzione amidasi fosse necessaria per la struttura e la funzione del T6SS, sono state testate varie versioni di TseP in mutanti del T6SS. Un particolare mutante ha mantenuto funzioni simili al T6SS selvatico, suggerendo che l'attività amidasi potrebbe non essere richiesta per l'assemblaggio del T6SS.

Test successivi hanno esaminato gli effetti combinati delle attività amidasi e del lisozima. È stato osservato che mentre TseP era più efficace di TsePC da solo, le versioni mutanti di TseP non avevano una funzione ridotta, evidenziando l'indipendenza di queste due attività.

#Diversità e funzione degli omologhi di TseP

I ricercatori hanno scoperto che proteine simili a TseP esistono in molti batteri Gram-negativi. Hanno scelto due omologhi particolari per vedere se avevano anche funzioni duali e in effetti hanno mostrato entrambe le attività amidasi e lisozima simili a TseP.

#Analisi delle caratteristiche genetiche

Analizzando il profilo genetico di queste proteine, hanno trovato differenze nel contenuto di GC che suggerivano cambiamenti genetici nel tempo. Questo supportava l'idea che le parti N- e C-terminale di TseP potessero originariamente provenire da proteine separate e si siano unite successivamente.

#Comprendere la struttura di TsePC

Per capire come TseP agisca sulle pareti cellulari batteriche, i ricercatori hanno analizzato la sua struttura attraverso la cristallizzazione. Hanno scoperto che TsePC aveva un design unico che gli permetteva di lavorare in modo più efficiente rispetto a un lisozima comunemente usato proveniente da uova di gallina.

La struttura ha rivelato una vasta scanalatura che era diversa dalla tipica scanalatura stretta trovata in altri lisozimi, il che potrebbe migliorare la sua attività enzimatica. I siti attivi di TsePC erano situati vicino a questa scanalatura, supportando la sua forte attività contro il peptidoglicano.

#Ingegnerizzare TsePC per attaccare batteri Gram-positivi

Studiano se TseP potesse degradare le pareti cellulari di diversi batteri, è stato scoperto che non poteva digerire efficacemente le pareti dei batteri Gram-positivi. Tuttavia, modificando alcune parti di TsePC, gli scienziati sono riusciti a aumentarne l'efficacia contro questi batteri.

Questa versione ingegnerizzata di TsePC poteva degradare le pareti cellulari di Bacillus subtilis, dimostrando che alterare le proprietà superficiali di TsePC poteva migliorare la sua attività antimicrobica.

#Utilizzare il T6SS per consegnare TsePC ingegnerizzato

Per vedere se il TsePC modificato potesse essere consegnato efficacemente dal T6SS per danneggiare i batteri Gram-positivi, i test hanno mostrato che, mentre veniva secreto a livelli più bassi rispetto al TsePC originale, riduceva comunque significativamente la sopravvivenza di Bacillus subtilis quando veniva usata la versione modificata.

Questi risultati dimostrano che il T6SS può essere dotato di un TsePC modificato per acquisire la capacità di attaccare i batteri Gram-positivi senza bisogno di contatto diretto.

#Conclusione e direzioni future

Il T6SS è importante per la competizione batterica, utilizzando varie proteine per eliminare i rivali. Studiando come funzionano queste proteine, potremmo sbloccare nuove fonti di opzioni antimicrobiche, offrendo approcci freschi per affrontare i crescenti problemi di AMR.

Questo studio ha introdotto TseP come un nuovo tipo di proteina bifunzionale con attività sia amidasi che lisozima. I risultati suggeriscono che queste proteine potrebbero essersi evolute insieme e evidenziano il potenziale di bioingegnerizzarle per diventare antimicrobici più potenti.

Infine, trovare nuovi modi per potenziare queste proteine potrebbe portare a trattamenti migliori per le infezioni batteriche, non solo nella sanità, ma anche nella sicurezza alimentare e nella salute animale. Guardando al futuro, le intuizioni ottenute da questa ricerca aprono nuove strade promettenti nella lotta contro la resistenza antimicrobica.