Avanzando la ricerca intestinale con organoidi porcini

Il tratto gastrointestinale (GIT) è fondamentale per scomporre il cibo, assumere nutrienti, eliminare i rifiuti e mantenere l'equilibrio del corpo. Il rivestimento del GIT gioca un ruolo chiave controllando cosa può passarci attraverso, come nutrienti, sale e acqua. Ci sono proteine speciali chiamate proteine delle giunzioni strette che aiutano a mantenere questo rivestimento integro e funzionante. Queste proteine fungono sia da barriera che da passaggio per le sostanze in entrata e in uscita.

Uno strato di muco, prodotto da cellule caliciformi, protegge il rivestimento da germi e danni fisici. Diversi canali e Trasportatori aiutano a muovere sostanze specifiche dentro e fuori le cellule. I ricercatori hanno principalmente studiato il GIT usando modelli animali, con i maiali che sono una scelta popolare perché le loro condizioni intestinali sono simili a quelle umane. Tuttavia, ci sono crescenti preoccupazioni etiche sull'uso di animali nella ricerca. Per questo motivo, gli scienziati si stanno orientando verso metodi alternativi come le colture cellulari per studiare il GIT.

#La Necessità di Modelli Migliori

Anche se le linee cellulari sono utili per alcuni studi, spesso si concentrano solo su un tipo di cella. Il colon ha molti tipi di cellule diverse, ognuna con il proprio ruolo. Per rappresentare meglio queste differenze, i ricercatori hanno sviluppato modelli di Organoidi, iniziando nel 2009. Gli organoidi sono gruppi di cellule che possono svilupparsi in diversi tipi di cellule epiteliali e possono rinnovarsi. Crescendo in uno strato bidimensionale, questi organoidi possono fornire informazioni preziose per capire come funziona l'intestino.

Un obiettivo specifico è esaminare come funzionano gli organoidi colici porcine a livello cellulare, inclusa l'espressione di determinati geni rispetto al tessuto reale. Questo studio analizzerà anche come questi organoidi trasportano sostanze, cosa fondamentale per il loro ruolo nella nutrizione e nella salute.

#Creare Organoidi 3D e 2D

Per creare organoidi 3D, i ricercatori isolano prima le cripte intestinali dal tessuto del colon suino. Poi li fanno crescere in un gel speciale chiamato Matrigel, che fornisce l'ambiente adatto per lo sviluppo degli organoidi. I ricercatori cambiano con attenzione il mezzo di crescita ogni pochi giorni e spezzano i gruppi che diventano troppo grandi.

Per creare organoidi 2D, prendono organoidi 3D già consolidati e li spezzano in strati singoli. Dopo averli trattati con enzimi specifici, le cellule vengono conteggiate e posizionate su inserti speciali per coltura cellulare. I ricercatori sostituiscono il mezzo ogni due giorni e misurano quanto bene le cellule si connettono tra loro.

#Analizzare le Cellule

Il decimo giorno di crescita, i ricercatori raccolgono le cellule per analizzare le loro caratteristiche. Usano vari metodi per studiare l'Espressione genica delle proteine delle giunzioni strette, essenziali per mantenere la funzione barriera del rivestimento intestinale.

Utilizzando kit specifici, i ricercatori estraggono RNA dalle cellule per determinare quanto di determinati geni viene espresso. Confrontando le colture di organoidi 2D con il tessuto nativo del colon, possono vedere se gli organoidi riflettono accuratamente il tessuto reale.

#Monitorare la Funzione Barriera

Un modo per valutare la salute dello strato cellulare è misurare la sua Resistenza Elettrica, nota come resistenza elettrica transepitale (TEER). Un TEER più alto indica una barriera più forte, necessaria per il corretto funzionamento dell'intestino. In questo studio, i valori di TEER sono aumentati nel tempo, raggiungendo un punto stabile dopo l'ottavo giorno di crescita.

Usando la microscopia elettronica, i ricercatori possono confermare visivamente l'integrità dello strato. Scoprono che lo strato di organoidi ha microvilli ben formati e cellule caliciformi che producono muco, entrambe importanti caratteristiche di un colon sano.

#Espressione Genica negli Organoidi

Il passo successivo è valutare se gli organoidi esprimono geni chiave che sono cruciali per la funzione intestinale. I ricercatori si concentrano su geni responsabili per il trasporto di sostanze importanti come sodio e cloruro. Scoprono che l'espressione di questi geni nella coltura di organoidi 2D è paragonabile a quella nel tessuto nativo.

Questa somiglianza è significativa perché dimostra che gli organoidi possono essere usati per studiare come funziona l'intestino in termini di assorbimento e secrezione dei nutrienti. Anche l'espressione genica delle mucine, componenti importanti del muco, non ha mostrato differenze significative confrontando organoidi e tessuto nativo.

#Investigare la Fisiologia del Trasporto

Per studiare ulteriormente come le sostanze si muovono attraverso lo strato di organoidi, i ricercatori hanno usato uno strumento chiamato camera di Ussing. Questo metodo consente loro di misurare come cambiano le correnti elettriche quando vengono aggiunte certe sostanze. Ad esempio, l'aggiunta di glucosio allo strato di organoidi ha causato un aumento della corrente elettrica, indicando che il glucosio veniva assorbito correttamente, dimostrando l'attività del trasportatore sodio-glucosio.

I ricercatori hanno anche testato come altre sostanze influenzassero la corrente, come la forskolina, che stimola la secrezione di cloruro. Hanno osservato che l'aggiunta di forskolina ha portato a cambiamenti significativi nella corrente elettrica, suggerendo che gli organoidi possono imitare la risposta del tessuto nativo.

#L'Impatto dell'Amiloride sui Canali del Sodio

L'amiloride è un farmaco che può bloccare l'ingresso del sodio nelle cellule. I ricercatori hanno testato come diverse concentrazioni di amiloride influenzassero la corrente elettrica negli organoidi. Hanno scoperto che a certe concentrazioni, l'amiloride diminuiva efficacemente la corrente, mostrando che influenzava i canali del sodio come previsto.

Quando gli organoidi sono stati pre-trattati con aldosterone, un ormone che aumenta l'assorbimento del sodio, i ricercatori volevano vedere se questo avrebbe cambiato la risposta della corrente. Tuttavia, hanno trovato che l'aggiunta di aldosterone non aveva un effetto significativo sulla corrente.

#L'Importanza della Funzione Barriera

Lo strato epiteliale nel colon è responsabile di fungere da barriera che controlla cosa può passare mentre protegge anche da sostanze dannose. La presenza di microvilli e cellule caliciformi nello strato di organoidi è coerente con ciò che si osserva in un colon sano.

Questa funzione barriera è cruciale per l'assorbimento dei nutrienti e per prevenire infezioni. L'espressione genica e la funzionalità osservate suggeriscono che gli organoidi sono in grado di mantenere una barriera selettiva, simile al tessuto naturale.

#Funzionalità dei Trasportatori e dei Canali

Le proteine di trasporto e i canali giocano un ruolo significativo nella funzione del colon. I livelli di espressione di alcune proteine, come i trasportatori di sodio e cloruro, sono rimasti costanti tra gli organoidi e il tessuto colico nativo. Questa coerenza indica che gli organoidi possono essere utilizzati per ulteriori studi.

I ricercatori hanno usato la camera di Ussing per testare quanto bene questi trasportatori funzionassero nelle colture di organoidi. Hanno scoperto che gli organoidi rispondevano al glucosio in modo simile a come farebbe il tessuto naturale, anche se c'erano alcune differenze nell'entità della risposta.

#Conclusione

Lo scopo di questa ricerca era creare un modello in vitro che rappresentasse accuratamente il colon suino per studiarne le proprietà funzionali. I risultati mostrano che la coltura 2D di organoidi colici porcini può formare un monostrato denso e sano, proprio come il tessuto naturale. I modelli di espressione genica sono simili, indicando che gli organoidi sono buoni modelli per la ricerca.

Questo studio dimostra che tali modelli hanno il potenziale di sostituire i test sugli animali per determinati progetti di ricerca, allineandosi con i principi etici che incoraggiano la riduzione, la sostituzione e il perfezionamento dell'uso degli animali negli esperimenti. I risultati forniscono anche una solida base per futuri studi relativi alla fisiologia e alle malattie del colon.