Avanzamenti nelle tecniche di imaging di spettrometria di massa

Studiare come si organizzano le biomolecole a un livello microscopico è fondamentale per capire come funzionano i sistemi biologici. Per farlo, abbiamo bisogno di strumenti di imaging di alta qualità che ci permettano di vedere i componenti cellulari nei loro posti reali. Uno dei migliori strumenti che abbiamo è la microscopia ottica, in particolare i metodi avanzati che ci permettono di vedere strutture più piccole di quanto sia normalmente possibile con la luce. Questi strumenti ci permettono di osservare in dettaglio posti all'interno delle cellule come gli organelli.

Tuttavia, questi metodi ottici si concentrano principalmente sulle proteine e utilizzano anticorpi molto specifici per queste proteine. Anche se gli anticorpi sono ottimi per trovare le proteine, limitano la nostra capacità di guardare altre piccole molecole come i metaboliti, perché abbiamo bisogno di sonde specifiche per vederle chiaramente. Inoltre, l'uso di coloranti fluorescenti può creare problemi con segnali sovrapposti, rendendo difficile ottenere immagini chiare di diverse molecole in un unico esperimento.

Un metodo alternativo chiamato imaging a spettrometria di massa (MSI), in particolare la desorbimento laser assistito da matrice–ionizzazione (MALDI-MSI), ci permette di vedere molti tipi di biomolecole come Lipidi, metaboliti e proteine senza bisogno di etichette speciali. A differenza dei metodi ottici, MALDI-MSI può rilevare piccole molecole senza doverci preoccupare di etichette o coloranti specifici. Tuttavia, gli strumenti commerciali standard per questa tecnica di solito non riescono a vedere dettagli molto fini, con una Risoluzione di circa 5 a 20 micrometri. Questo livello di dettaglio non è sufficiente per osservare strutture molto piccole all'interno delle cellule.

Per migliorare questa risoluzione, gli scienziati hanno ideato varie tecniche. Un modo è modificare come il laser colpisce il campione da dietro il vetrino e focalizzarlo sulla superficie, il che ha migliorato la risoluzione a circa 1,2 micrometri. Un'altra tecnica prevede l'uso di lenti speciali per ridurre lo spazio tra la lente e il campione. Questo aggiustamento può ridurre il punto di messa a fuoco del laser a circa 1,4 micrometri. Tuttavia, questi metodi richiedono spesso strumenti complicati e una gestione attenta dei campioni, il che può rendere difficile il loro uso su larga scala.

Un altro problema con alcune di queste tecniche avanzate è che il modo in cui prepariamo i campioni può ridurre la loro sensibilità, portando a dati meno chiari. Alcune tecniche possono fornire un alto dettaglio ma possono rompere le molecole, rendendo difficile raccogliere informazioni utili sui campioni.

Al contrario, un metodo più recente chiamato Microscopia di Espansione (ExM) può migliorare la nostra capacità di vedere dettagli piccoli senza bisogno di allestimenti ottici avanzati. ExM funziona ingrandendo i Campioni Biologici con un gel speciale, permettendo di ottenere immagini più dettagliate con microscopi normali. Da quando ExM è stato introdotto, è stato adattato per vari tipi di campioni biologici e tecniche di imaging. I ricercatori hanno persino sviluppato un nuovo tipo di imaging a spettrometria di massa usando i principi di ExM, ottenendo una risoluzione migliore intorno a 1 micrometro. Tuttavia, i metodi tradizionali di MALDI-MSI sono ancora indietro in termini di risoluzione.

Questo articolo presenta un nuovo metodo: MALDI-MSI a espansione dieci volte (10X ExMSI), che aiuta a ottenere una risoluzione molto più alta di circa 500 nanometri. Questo nuovo metodo permette agli scienziati di esaminare i campioni biologici in dettaglio, rendendo più facile studiarne la composizione chimica e come differiscano l'uno dall'altro.

#Sviluppo del Workflow 10X ExMSI

Per creare il metodo 10X ExMSI, i ricercatori hanno dovuto sviluppare un nuovo workflow per immagini ad alta risoluzione a scala cellulare. Il processo inizia prelevando tessuto fissato e tagliandolo in fette sottili. Queste fette vengono poi messe in una camera speciale per aiutare a fissare le proteine in una matrice di gel. Dopo aver trattato il tessuto con un enzima per rompere le proteine, il gel viene lasciato espandere liberamente.

Il metodo richiede attenzione ai dettagli in ogni fase. Ad esempio, è fondamentale che il gel venga capovolto durante l'espansione, così il campione è rivolto verso l'alto. Questa orientazione assicura che il laser possa penetrare nel gel e raggiungere correttamente il tessuto. Una volta che il gel si espande, viene asciugato e preparato per l'imaging a spettrometria di massa.

I ricercatori misurano anche la dimensione del campione prima e dopo l'espansione per determinare quanto è ingrandito. Nei test, hanno scoperto che un fattore di espansione dieci volte è raggiungibile con questo metodo, permettendo un livello di risoluzione molto fine.

Con la risoluzione spaziale migliorata, gli scienziati possono distinguere tra diverse parti del campione che prima non potevano vedere. Ad esempio, possono vedere chiaramente il nucleo nei campioni di tessuto cerebrale, qualcosa che i metodi di imaging standard non riuscivano a risolvere efficacemente.

#Ottimizzazione della Deposizione della Matrice per Imaging di Alta Qualità

Applicare una matrice in modo uniforme sul campione è essenziale per ottenere i migliori risultati di imaging a spettrometria di massa. Alcune matrici si sono dimostrate molto efficaci per l'imaging ad alta risoluzione, e queste sono state scelte per l'uso nel metodo 10X ExMSI. Se le particelle della matrice sono troppo grandi, possono causare una dispersione delle molecole, che influisce sulla risoluzione. Pertanto, i ricercatori hanno controllato attentamente la dimensione della matrice per garantire un campionamento efficace.

Un dispositivo speciale è stato progettato per aiutare ad applicare questa matrice in modo preciso. I parametri sono stati personalizzati per garantire che il metodo di applicazione della matrice fornisse la massima sensibilità per il processo di imaging.

Una delle principali forze dell'approccio ExMSI è che non richiede condizioni rigide per l'applicazione della matrice, a differenza di alcuni metodi tradizionali che hanno opzioni molto limitate. Il metodo 10X ExMSI mostra grandi promesse per migliorare ulteriormente la risoluzione.

#Alta Copertura dei Percorsi Lipidici

Per testare l'efficacia del 10X ExMSI, i ricercatori hanno utilizzato campioni di cervello di topo. Hanno preparato due tipi di campioni, uno con il nuovo metodo di espansione e l'altro senza, per vedere come si confrontavano. I campioni espansi hanno mostrato molti segnali forti quando analizzati, indicando che il processo non ha causato una perdita significativa di lipidi.

Gli scienziati sono stati in grado di identificare molti tipi diversi di lipidi sia nei campioni espansi che in quelli standard. Hanno scoperto che il processo di espansione cambiava la forma in cui alcuni lipidi venivano rilevati, portando a dati nuovi ed emozionanti sui modelli di distribuzione dei lipidi.

I risultati hanno mostrato un aumento significativo nella rilevazione di alcune specie lipidiche dopo l'espansione, in particolare nella modalità di ioni positivi, evidenziando i benefici del nuovo metodo. In generale, il processo di espansione ha portato a una molto migliore ritenzione dei campioni lipidici e ha aumentato il numero di specie rilevate.

#Imaging del Cervello e del Cervelletto di Topo

Un'area importante di ricerca è l'ippocampo nel cervello di topo, che gioca un ruolo chiave nella memoria e nell'apprendimento. Usando il metodo 10X ExMSI, gli scienziati sono stati in grado di vedere più chiaramente la fine struttura dell'ippocampo rispetto ai metodi tradizionali. Il nuovo imaging ha mostrato maggior dettaglio in diverse regioni del tessuto, permettendo ai ricercatori di visualizzare aree importanti che in precedenza erano poco chiare.

Miglioramenti simili sono stati osservati durante l'imaging del cervelletto. Il metodo 10X ExMSI ha fornito una visualizzazione più chiara dei vari strati e strutture all'interno del cervelletto, mostrando differenze distinte nella distribuzione dei lipidi. Questi risultati sottolineano la capacità del nuovo metodo di rivelare dettagli importanti nell'architettura cerebrale che sono vitali per comprendere la sua funzione.

#Alta Risoluzione Spaziale in Esperimenti Futuri

Man mano che i ricercatori continuavano a perfezionare il metodo 10X ExMSI, hanno effettuato ulteriori test di imaging per chiarire le strutture a scale molto piccole. Usando una dimensione del punto laser più piccola, sono riusciti ad ottenere immagini ancora più chiare delle strutture cerebrali. Hanno scoperto che il metodo forniva effettivamente una risoluzione sub-micrometrica, permettendo agli scienziati di identificare neuroni singoli e le loro connessioni.

La risoluzione migliorata ha rivelato nuove intuizioni su come diversi tipi di cellule cerebrali, come le cellule di Purkinje, sono organizzate. Le reti dendritiche di queste cellule sono state visualizzate chiaramente, il che è un risultato significativo nel campo dell'imaging.

#ExMSI su Cellula Singola

I ricercatori volevano anche vedere se il metodo 10X ExMSI potesse essere utilizzato per analizzare cellule singole, non solo sezioni di tessuto. Per testarlo, hanno esaminato cellule A549, un tipo di linea cellulare di carcinoma polmonare umano. Lo spettro di massa ha mostrato varie specie lipidiche distribuite all'interno delle cellule.

Il nuovo metodo di imaging ha fornito viste dettagliate delle cellule, permettendo agli scienziati di osservare come diversi lipidi siano distribuiti all'interno della cellula. Sono stati in grado di confrontare le distribuzioni lipidiche nei campioni espansi e standard e hanno scoperto che la tecnica di espansione migliorava significativamente la chiarezza delle immagini.

Questa capacità di rilevare dettagli a livello di cellula singola apre nuove possibilità per comprendere i ruoli che i lipidi svolgono in diversi stati cellulari e le variazioni tra le cellule.

#Conclusione

Lo sviluppo del metodo 10X ExMSI segna un nuovo capitolo nell'imaging biologico. Combinando tecniche di ionizzazione dolce con l'espansione del campione, questo metodo migliora la risoluzione e permette l'esame dettagliato dei campioni biologici. Attraverso tecniche di imaging più raffinate, i ricercatori possono comprendere meglio i ruoli complessi dei lipidi e di altre biomolecole a livello subcellulare.

Man mano che la comunità scientifica esplora questo potente nuovo strumento, ci si aspetta che contribuisca a progressi in aree come neurobiologia, ricerca sul cancro e lipidomica. La capacità di visualizzare strutture con tale finezza potrebbe portare a una comprensione più profonda di come funzionano i processi biologici e come possano essere influenzati.