Nueva herramienta predice las mejores ubicaciones para etiquetas de proteína

Los científicos usan Anticuerpos para ayudarles a estudiar Proteínas en las células. Los anticuerpos pueden mostrar dónde se encuentran las proteínas, cuánto hay de ellas, cómo se mueven dentro de las células y cómo interactúan entre sí. Sin embargo, encontrar anticuerpos de alta calidad para la mayoría de las proteínas vertebradas puede ser muy complicado. Muchas empresas venden anticuerpos para proteínas específicas, pero a menudo no funcionan bien en entornos celulares reales o pueden no dirigirse a la proteína correcta. Crear anticuerpos personalizados en laboratorios también es costoso y lleva mucho tiempo, y estos esfuerzos a menudo fallan, desperdiciando recursos valiosos en la investigación.

Una opción es crear proteínas con Etiquetas especiales que los anticuerpos puedan reconocer, pero este método tiene sus desafíos. Añadir etiquetas simples a los extremos de las proteínas puede causar problemas, especialmente si esos extremos son importantes para la función de la proteína. Un método alternativo implica crear grupos de etiquetas internas usando una técnica compleja, lo cual es efectivo pero también requiere mucho trabajo. Esta situación crea una clara necesidad de herramientas fáciles de usar que puedan predecir con precisión dónde se pueden añadir etiquetas a las proteínas sin afectar su función.

#Herramientas Disponibles

Hay muchos recursos en línea que pueden ayudar a encontrar los lugares adecuados para añadir etiquetas en las proteínas. Estos recursos analizan varias características, como la similitud de una proteína entre diferentes especies, su forma prevista, cuán accesibles son cada una de las partes de la proteína, y si ciertas áreas de la proteína son propensas a ser flexibles o desordenadas. Estudios anteriores han demostrado que usar estas características juntas puede ayudar a predecir los mejores lugares para añadir etiquetas a las proteínas.

#La Herramienta EpicTope

Presentamos una nueva herramienta llamada EpicTope que combina estas características para encontrar los mejores lugares para añadir etiquetas a las proteínas sin interrumpir su función. Para asegurar que EpicTope funcione bien, lo probamos en una proteína llamada Smad5 en peces cebra. Smad5 es una parte importante de una vía de señalización que ayuda a controlar el desarrollo celular en peces cebra. Esta proteína es muy similar entre diferentes especies, lo que hace que etiquetarla sea un desafío porque incluso un pequeño cambio puede afectar su rendimiento.

Usamos EpicTope para encontrar dos sitios internos en Smad5 donde pudiéramos añadir etiquetas V5. Luego creamos diferentes versiones de la proteína Smad5 con estas etiquetas, así como versiones con etiquetas en los extremos de la proteína para comparación. Nuestros experimentos mostraron que las proteínas Smad5 con etiquetas internas funcionaron correctamente en embriones de peces cebra, mientras que las que tenían etiquetas en los extremos no. También confirmamos que las etiquetas internas permitieron que las proteínas fueran reconocidas por los anticuerpos.

#Cómo Funciona EpicTope

EpicTope analiza varias características de una proteína para ayudar a decidir dónde añadir una etiqueta. Empieza seleccionando una proteína basada en un identificador específico. Luego, recopila información sobre la secuencia de aminoácidos y la estructura prevista de la proteína. Esta estructura ayuda a entender la forma de la proteína y cómo sus partes interactúan entre sí.

A continuación, EpicTope utiliza un método para evaluar cuán similar es la proteína a sus contrapartes en otras especies. Examina qué partes de la proteína probablemente sean estructuradas (como hélices alfa o láminas beta) o desordenadas. EpicTope también verifica cuán abiertas o cerradas están diferentes regiones de la proteína, así como las áreas de unión que pueden ser importantes para su función.

Una vez que se recopila toda esta información, EpicTope puede dar puntajes que ayudan a identificar los mejores lugares para añadir etiquetas a la proteína. Las posiciones con los puntajes más altos indican buenos lugares para etiquetar que probablemente no interfirieran con el trabajo de la proteína.

#Pruebas de EpicTope

Para probar qué tan bien funciona EpicTope, nos enfocamos en la proteína Smad5 en peces cebra. Usando la herramienta, resaltamos dos posiciones específicas dentro de la proteína Smad5 para añadir etiquetas V5. Luego, realizamos experimentos para verificar si estas versiones etiquetadas de Smad5 podían seguir funcionando normalmente.

En nuestras pruebas, inyectamos embriones de peces cebra que carecían de Smad5 funcional con las diferentes versiones de Smad5. Los embriones que recibieron Smad5 etiquetado internamente con V5 mostraron una mejora significativa en su desarrollo, lo que indica que esas proteínas aún podían realizar bien sus tareas. Sin embargo, los embriones inyectados con versiones de Smad5 con etiquetas en los extremos no mostraron resultados similares, confirmando que esas etiquetas obstaculizaban la función de la proteína.

También revisamos los niveles de las proteínas etiquetadas para ver si las etiquetas afectaban su estabilidad. Las etiquetas internas parecían ser estables y presentes en los embriones, mientras que la versión con la etiqueta al principio era mucho menos estable. Esto reforzó la idea de que las etiquetas internas eran ventajosas.

#Visualización de la Localización de Proteínas

Para examinar más a fondo la efectividad de nuestro enfoque de etiquetado, usamos un método llamado inmunofluorescencia para ver dónde estaban localizadas las proteínas Smad5 en los embriones. Tinteamos los embriones con marcadores especiales que se unen a las etiquetas V5 y observamos sus posiciones usando un microscopio potente.

Nuestras observaciones mostraron que las proteínas Smad5 etiquetadas con V5 estaban presentes en las áreas esperadas dentro de las células, particularmente en los núcleos donde ocurre la acción relacionada con la señalización BMP. Esto se alineó con los hallazgos de los experimentos de rescate de los embriones. Mientras tanto, las versiones con etiquetas en los extremos no mostraron patrones similares en la tinción.

#Conclusión

El trabajo realizado aquí demuestra que EpicTope es una herramienta valiosa para los científicos que buscan predecir dónde colocar etiquetas en las proteínas sin interrumpir su función. Al emplear EpicTope, los investigadores pueden generar proteínas etiquetadas que permanezcan funcionales y accesibles a los anticuerpos para futuros estudios.

Nuestro enfoque es prometedor para diversas aplicaciones, desde rastrear proteínas en células vivas hasta identificar objetivos específicos para estudios de regulación genética. Esperamos que EpicTope ayude a muchos investigadores en sus búsquedas por explorar el complejo mundo de las proteínas y sus roles en los organismos vivos.