Avances en la Medición de la Orientación de Moléculas Fluorescentes

Medir cómo están orientadas las moléculas fluorescentes puede dar información valiosa sobre estructuras y actividades en biología y ciencia de materiales. Al fijar un marcador fluorescente a una muestra biológica que se mueve con la estructura, los científicos pueden aprender sobre su comportamiento observando la orientación del marcador. Muchos Marcadores fluorescentes iluminan de una manera específica cuando se excitan con luz, así que los investigadores pueden usar microscopios especiales para ver cómo cambia el patrón de luz. Esto les ayuda a entender la orientación de los marcadores.

Hay varias técnicas que hacen mediciones en áreas pequeñas limitadas por el tamaño de la luz utilizada. Al hacer muchas mediciones del mismo lugar con diferentes configuraciones de luz, los investigadores pueden calcular la orientación de los marcadores fluorescentes. Esto ha sido útil para estudiar varios fenómenos biológicos como membranas celulares, dinámicas de proteínas y diferentes materiales.

Recientemente, nuevos métodos han permitido a los científicos medir moléculas individuales. Estas técnicas ahora pueden proporcionar más información, incluyendo la posición y orientación de las moléculas, lo cual es valioso para estudiar cosas como cómo el ADN cambia de forma bajo estrés, o el comportamiento de proteínas específicas. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones relacionadas con cuán rápido pueden tomar Medidas y los tipos de marcadores que se pueden usar.

Después de revisar las técnicas disponibles, se encontró una brecha en la capacidad de medir tanto la orientación como la posición de grupos de marcadores fluorescentes. Se propuso un nuevo sistema llamado sistema de hoja de luz de vista dual. Este montaje tiene dos brazos para excitar y detectar luz, lo que permite una iluminación más variada y mejor resolución al observar muestras.

#Usando Polarizadores de Cristal Líquido

En las primeras pruebas, se añadieron polarizadores de cristal líquido a ambos brazos de este nuevo sistema de hoja de luz para ver cómo se podía medir la orientación de los marcadores fluorescentes en áreas pequeñas. Sin embargo, combinar los datos de moléculas individuales con los métodos tradicionales usados para grupos de moléculas resultó difícil. Se desarrolló un nuevo enfoque inspirado en una técnica de imagen existente llamada imagen por resonancia magnética de tensor de difusión para ayudar a medir la orientación tridimensional de los marcadores fluorescentes de manera más efectiva.

Este nuevo método se centró en usar una Función de Distribución de Orientación, que es una forma de representar y analizar la orientación de los marcadores. Permitió a los científicos identificar problemas en las mediciones y crear una solución, llamada inclinación de la hoja de luz. Este ajuste mejoró la capacidad para resolver ambigüedades de orientación. Los resultados posteriores mostraron varias estructuras en células, incluyendo membranas y complejos de proteínas.

#Comprendiendo las Funciones de Distribución de Orientación (ODFs)

Las funciones de distribución de orientación (ODFs) sirven como modelos para representar cómo están orientados los marcadores fluorescentes en un área específica. Para muchos marcadores comunes, es razonable asumir que sus patrones de absorción y emisión pueden simplificarse a un solo eje. Al resumir todos los marcadores dentro de un área pequeña, los investigadores pueden visualizar la ODF como una función esférica, donde el tamaño de la esfera representa el número de marcadores orientados en cada dirección.

Los marcadores fluorescentes pueden rotar mientras son medidos, lo que lleva a cambios en las ODFs. La forma en que estos marcadores son excitados y emiten luz significa que sus patrones siempre son simétricos. Así, las ODFs pueden usarse eficazmente para modelar el comportamiento de grupos de marcadores dentro de estructuras biológicas.

Diferentes formas de ODFs pueden representar varios comportamientos de los marcadores fluorescentes. Por ejemplo, marcadores que pueden rotar libremente mostrarán una ODF esférica, mientras que aquellos que están restringidos a una superficie tomarán formas diferentes. Entender estas ODFs es crucial para interpretar cómo se comportan los marcadores fluorescentes en diferentes entornos.

#Excitación y Detección de Vista Dual

En esta sección, se explica la configuración del sistema de hoja de luz de vista dual. Este sistema consiste en dos lentes de inmersión en agua que pueden tanto excitar como detectar luz. Al usar estas lentes, los investigadores pueden crear diferentes patrones de excitación para estudiar las muestras. La capacidad de alternar entre diferentes configuraciones de iluminación permite la excitación selectiva de marcadores específicos en la muestra.

El uso de descomposiciones armónicas esféricas permite a los investigadores simular y analizar ODFs para entender mejor sus diseños. Las simulaciones muestran cómo las ODFs pueden descomponerse en componentes más simples, lo que ayuda a sacar conclusiones sobre las muestras estudiadas.

El sistema de imagen permite mejorar las mediciones y puede capturar mucha información sobre las orientaciones 3D de los marcadores fluorescentes. Los datos pueden visualizarse de varias maneras, incluyendo mostrar dónde están la mayoría de los marcadores orientados o la densidad de marcadores en diferentes áreas.

#Superando Desafíos de Medición con la Inclinación de la Hoja de Luz

Durante el proceso de imagen, se encontró que ciertos componentes angulares de los datos estaban faltando, lo que llevó a dificultades para recuperar todas las orientaciones. Al añadir capacidades de inclinación al sistema de hoja de luz, los científicos pudieron iluminar la misma área de muestra mientras accedían a nueva información angular.

Este cambio ayuda a producir mejor contraste e iluminar más orientaciones, permitiendo una comprensión más completa de cómo están orientados los marcadores en tres dimensiones. Los investigadores descubrieron que usar una combinación de diferentes mediciones con las hojas de luz inclinadas mejoró su capacidad para resolver las formas de las ODFs y medir orientaciones con precisión.

El nuevo montaje fue validado al examinar vesículas unilamelares gigantes (GUVs) y mostró que los marcadores fluorescentes se alinearon como se esperaba. La capacidad de corregir problemas de medición anteriores demostró los beneficios del enfoque de inclinación, llevando a resultados más precisos.

#Validación con Muestras Biológicas

Después de establecer que la inclinación de la hoja de luz mejoraba la recuperación de orientación, el método se utilizó para estudiar varias muestras biológicas. El sistema se probó usando GUVs, xilema de plantas, y proteínas de actina en células.

En las pruebas de GUV, se analizaron las ODFs y orientaciones pico, mostrando que los marcadores apuntaban consistentemente hacia afuera de la superficie como se había predicho. Los montajes demostraron ser capaces de detectar cambios sutiles en la orientación.

Al examinar células de xilema, las ODFs reflejaron las orientaciones esperadas de las estructuras de celulosa, confirmando el conocimiento previo de estudios centrados en observaciones bidimensionales. Las mediciones demostraron la precisión del sistema y su capacidad para revelar nuevas ideas sobre estructuras tridimensionales.

Finalmente, se analizaron las proteínas de actina en células U2OS para mapear sus orientaciones. Los resultados confirmaron la alineación esperada de los filamentos de actina a lo largo de sus ejes largos, mostrando la efectividad del sistema para visualizar estructuras complejas en tres dimensiones.

#Investigando el Comportamiento Celular en Nanocables

El sistema se utilizó además para estudiar fibroblastos de ratón cultivados en arreglos de nanocables. Este montaje ayuda a investigar cómo las células interactúan con su entorno circundante.

Las imágenes mostraron que los filamentos de actina se alineaban con los nanocables más cercanos, permitiendo a los científicos explorar el comportamiento celular local. Los modelos reconstruidos indicaron poblaciones distintas de orientaciones de actina y se utilizaron para derivar métricas que ilustran cómo estos filamentos interactuaban con su entorno local.

Los investigadores compararon resultados de diferentes arreglos de nanocables y encontraron que las orientaciones de actina variaban significativamente según el sustrato. Los datos revelaron una correlación entre el comportamiento local de los filamentos de actina y la forma general de las células, proporcionando ideas sobre cómo la arquitectura celular se relaciona con la matriz extracelular subyacente.

#Conclusiones

Los avances en medir las orientaciones de moléculas fluorescentes han establecido un puente entre estudios bidimensionales y conocimientos tridimensionales. La introducción de técnicas como las funciones de distribución de orientación ha refinado la forma en que los científicos analizan los datos de los marcadores fluorescentes. El sistema de hoja de luz de vista dual, mejorado a través de la inclinación de la hoja de luz, ha permitido mediciones más precisas, llevando a nuevos descubrimientos sobre estructuras biológicas.

Todavía hay potencial para mejorar estos sistemas de imagen, particularmente en aumentar la velocidad de medición y mejorar la uniformidad de las respuestas. Trabajos futuros pueden introducir nuevos marcadores fluorescentes y explorar mediciones en tiempo resolutivo para entender mejor el comportamiento dinámico de sistemas biológicos complejos.

En general, el trabajo ha ampliado las capacidades para estudiar orientaciones moleculares, permitiendo a los investigadores obtener una comprensión más profunda de fenómenos biológicos y materiales en tres dimensiones.