Avanzando el Screening de Alto Rendimiento con Diseños CRowS

La screening de alto rendimiento (HTS) es un método que se usa en varios campos científicos, principalmente en el descubrimiento de medicamentos, para probar un montón de Compuestos rápidamente. Esto implica usar placas multicavidad que pueden contener muchas muestras, permitiendo a los investigadores evaluar cómo interactúan diferentes compuestos con objetivos Biológicos específicos.

A medida que la tecnología para manejar líquidos y las herramientas de screening han mejorado, el número de compuestos que se pueden probar ha aumentado significativamente. Este crecimiento crea la necesidad de mejores métodos experimentales y Estadísticos para mejorar el proceso de screening.

Proponemos un nuevo sistema para hacer que el HTS sea más flexible, rentable y estadísticamente sólido. Esto implica un nuevo diseño para asignar múltiples compuestos a cada cavidad de la placa mientras se gestionan las limitaciones de cuántos compuestos se pueden agregar. Nuestro nuevo diseño, llamado diseños supersaturados con restricciones de fila, utiliza técnicas estadísticas para analizar los datos de manera más efectiva. También presentamos formas de construir estos diseños utilizando métodos computacionales.

#Antecedentes sobre la Screening de Alto Rendimiento

La screening de alto rendimiento es una práctica común en biología e investigación farmacéutica. Permite a los científicos probar muchos compuestos simultáneamente, ayudando a identificar cuáles son los más prometedores para un estudio más profundo. En este proceso, cada cavidad de muestra generalmente contiene un solo compuesto, y ocurre una reacción biológica, seguida de la medición del resultado. Este método puede producir una cantidad significativa de datos, mostrando cómo diferentes compuestos afectan los sistemas biológicos.

A pesar de los avances en métodos y herramientas, los investigadores a menudo dependen de un enfoque simple: asignar un compuesto a cada cavidad y evaluar si el resultado es significativo. Aunque es sencillo, esta técnica puede perder hits potenciales entre miles de candidatos. Desarrollos recientes, como los métodos de aprendizaje automático, han buscado mejorar este proceso seleccionando los mejores compuestos por adelantado. Nuestro método complementa estas nuevas tecnologías creando datos de entrenamiento para estos modelos.

#Estrategias de Agrupamiento Existentes

Algunos métodos existentes permiten combinar múltiples compuestos en cada cavidad. Uno de estos métodos se llama agrupamiento no adaptativo, que puede filtrar muchos compuestos con menos placas. Este enfoque utiliza lo que se conoce como Diseños Transversales Desplazados (STDs), que agrupan compuestos juntos para minimizar la superposición. Sin embargo, estos métodos asumen que las respuestas se pueden categorizar simplemente como "hit" o "inactivo," y requieren que el usuario estime los resultados esperados y las tasas de error.

Si bien los STDs son rápidos de configurar, tienen limitaciones ya que no tratan el diseño y análisis como un problema estadístico. Nuestro método aborda el problema como un experimento diseñado estadísticamente, lo que permite un mejor control sobre las tasas de falsos positivos mientras identifica con éxito los verdaderos hits.

#Nuestro Método Propuesto: Screening con Restricciones de Fila (CRowS)

Nuestro enfoque utiliza una técnica de diseño estadístico conocida como diseño supersaturado (SSD) para determinar qué compuestos se asignan a cada cavidad. En este caso, podemos probar múltiples compuestos en cada cavidad mientras controlamos el potencial de falsos positivos. Los SSDs están diseñados para incluir más compuestos que corridas, un método que se ha refinado a lo largo de los años.

En nuestro trabajo, nos enfocamos en crear diseños que se adhieran al número de compuestos que se pueden aplicar de manera realista a cada cavidad. Esto es crucial porque limitaciones prácticas, como el tamaño físico de las cavidades y la concentración mínima necesaria para la detección, restringen cuántos compuestos se pueden incluir. Nos referimos a estas como restricciones de fila ya que limitan el número de compuestos activos por fila en el diseño.

Para desarrollar estos diseños, aplicamos métodos computacionales para construirlos de manera eficiente. Analizamos la calidad de los diseños y su impacto en los resultados del screening a través de estudios de simulación.

#Algoritmo de Construcción para Diseños CRowS

Para crear nuestros diseños con restricciones de fila, empleamos un algoritmo específico que optimiza el diseño mientras respeta las limitaciones que discutimos. El algoritmo se centra en asegurarse de que los diseños cumplan con los requisitos estadísticos mientras se adhieren a las restricciones de fila. Lo hace evaluando posibles cambios en el diseño y determinando si estos cambios mejoran la calidad estadística general.

Usando este proceso, generamos diseños que representan la forma más efectiva de asignar compuestos a las cavidades, permitiendo un mejor análisis de los resultados.

#Propiedades de los Diseños CRowS

Nuestros nuevos diseños ofrecen varias ventajas. Son estadísticamente sólidos y proporcionan una mejor manera de manejar las complejidades de la screening biológica. Al usar simulaciones, mostramos que estos diseños funcionan bien incluso cuando enfrentan restricciones estrictas. Específicamente, investigamos cómo se comportan los diseños bajo restricciones de fila ajustadas, brindando información sobre su desempeño y efectividad estadística.

Descubrimos que a medida que aumentaron las restricciones sobre el número de compuestos por cavidad, nuestros diseños aún identificaban con éxito compuestos activos. Así, nuestros métodos demuestran flexibilidad y fiabilidad en la identificación de candidatos prometedores en un proceso de screening.

#Comparación de Métodos de Screening Biológico

La mayoría del screening biológico todavía se hace usando el método estándar de un compuesto por cavidad, que es simple pero tiene limitaciones. Comparamos nuestro método, CRowS, con estrategias existentes como el método poolHiTS que también permite cierto agrupamiento de compuestos.

Nuestras comparaciones se centran en su capacidad para detectar compuestos activos, observando métricas como la tasa de verdaderos positivos (TPR), que mide qué tan efectivamente un método identifica hits reales, y la tasa de falsos positivos (FPR), que mide cuántos compuestos inactivos son incorrectamente etiquetados como hits.

Nuestras simulaciones mostraron que CRowS superó a los otros métodos en la identificación de verdaderos hits mientras mantenía bajos falsos positivos. Esto es especialmente importante en escenarios de screening donde se involucran miles de compuestos, ya que altas tasas de falsos positivos podrían llevar a experimentos de seguimiento innecesarios.

#Aplicaciones en el Mundo Real: Inhibidores de Metalo-β-lactamasa

Para demostrar la efectividad de nuestro método CRowS, realizamos experimentos enfocados en encontrar inhibidores de una enzima específica conocida como Metalo-β-lactamasa 2 codificada por Verona Integron (VIM-2). Esta enzima es problemática porque se encuentra en bacterias que causan infecciones graves y está asociada con altas tasas de resistencia a antibióticos.

En nuestros experimentos, probamos diferentes diseños para ver qué tan bien podían identificar un inhibidor entre compuestos inertes conocidos. Adaptamos nuestros diseños a diferentes condiciones, incluyendo escenarios tanto restringidos como no restringidos respecto al número de compuestos por cavidad.

Los resultados mostraron que nuestro método CRowS identificó de manera confiable el inhibidor conocido en varios entornos experimentales, incluso cuando el número de compuestos era limitado. Esto destaca el potencial del método para abordar desafíos del mundo real en el descubrimiento de medicamentos.

#Conclusión

En este trabajo, presentamos un nuevo enfoque para el screening biológico utilizando diseños supersaturados con restricciones de fila. Estos diseños mejoran la capacidad de probar múltiples compuestos en una sola cavidad mientras mantienen la rigurosidad estadística necesaria para un análisis efectivo.

El método CRowS ofrece ventajas significativas sobre las técnicas de screening tradicionales, mostrando mejor desempeño en la identificación de verdaderos hits mientras controla los falsos descubrimientos. Nuestros hallazgos sugieren que incluso con restricciones en el número de compuestos, es posible distinguir efectivamente entre factores activos e inactivos.

Aunque nuestros experimentos iniciales fueron de menor escala, creemos que la metodología puede ampliarse a diseños más grandes, acomodando cientos o incluso miles de factores en screenings de alto rendimiento. Este potencial conduce a diversas nuevas oportunidades y desafíos para la exploración futura en las comunidades de investigación estadística y biológica.

Aunque el método CRowS muestra gran promesa, también hay limitaciones y desafíos por abordar. Por ejemplo, a medida que aumentan las filas y tamaños de los factores, construir estos diseños puede volverse lento. Además, las interacciones entre compuestos son una preocupación que planeamos investigar más a fondo para refinar nuestros métodos.

A través de nuestros estudios, buscamos entender mejor la efectividad de nuestras estrategias de diseño y explorar su potencial completo en el ámbito del descubrimiento de medicamentos y la screening biológica.