Innovative RNA-Kontrollen für Virustests

Die Coronavirus-Pandemie hat einen riesigen Bedarf an schnellen Tests geschaffen, die das Virus bei Leuten nachweisen können. Techniken wie Echtzeit-RT-PCR und RT-LAMP haben sich als präzise Werkzeuge zur Diagnose des Virus erwiesen.

Um Viren erfolgreich zu finden, ist es wichtig, Qualitätskontrollmassnahmen zu haben. Dazu gehört die Überprüfung der Tests, die fortgeschrittene Sequenzierungs- und Amplifikationsmethoden wie RT-PCR und RT-LAMP nutzen. Normalerweise sind Kontrollen, die auf viralem Material von infizierten Patienten oder lebenden Viren basieren, mit Sicherheitsrisiken verbunden. Um diese Risiken zu vermeiden, können synthetische RNA-Kontrollen hergestellt werden, die helfen, verschiedene Virusvarianten sicher zu testen. Ausserdem, da die Technologie zur Herstellung von DNA gängig ist, können neue RNA-Kontrollen schnell entwickelt werden, wenn neue Virusvarianten auftauchen.

Allerdings ist RNA nicht sehr stabil. Sie kann schnell zerfallen, wenn sie nass oder trocken ist. Das macht es schwierig für Labore, die grosse Mengen an Kontroll-RNA benötigen. Imagene hat ein Verfahren, das RNA sicher aufbewahrt. Dabei wird die RNA getrocknet und in speziellen Kapseln mit Argongas verpackt. Dieser Prozess hilft, RNA sicher bei Raumtemperatur zu lagern und zu transportieren.

In dieser Studie haben wir synthetische RNA-Kontrollen verwendet, die von Twist Bioscience hergestellt wurden. Diese Kontrollen wurden an fünf verschiedene Labore verteilt, um ihre Wirksamkeit zu testen. Das Ziel war sicherzustellen, dass die Tests das Virus zuverlässig nachweisen können und dass die RNA mindestens 10 Jahre bei Raumtemperatur stabil bleibt. Wir haben verschiedene RT-PCR-Geräte und -Kits verwendet, um drei verschiedene Varianten des Virus und fünf Genziele zu testen.

#Materialien und Methoden

Die RNA-Proben, die von Twist Bioscience hergestellt wurden, wurden auf Trockeneis zu Imagene versendet. Ein Teil dieser Proben wurde unverändert an Bordeaux CHU geschickt, während der andere Teil verkapselt wurde. Einige der verkapselten Proben wurden erhitzt, um 10 Jahre Lagerung bei Raumtemperatur nachzuahmen. Die verbleibenden Aliquote wurden an Bordeaux, Limoges, Poitiers CHUs, CIRAD Réunion und ein privates Labor in Salon de Provence geschickt.

#RNA-Kontrollvorbereitung

Die synthetischen SARS-CoV-2 RNA-Moleküle von Twist Bioscience wurden in 100 μL Lösungen vorbereitet. Diese wurden in kleinere Portionen aufgeteilt und bei –80 °C gelagert. Nach dem Auftauen wurde die RNA mit einer speziellen Stabilisierungslösung verdünnt, bevor sie in Glas- kapseln gefüllt wurde.

Die RNA wurde dann getrocknet und mit Argongas verkapselt. Ein Satz von Kapseln für jede RNA-Variante wurde automatisch erhitzt, um die Langzeitlagerung zu simulieren. Die Kapseln wurden später bei Raumtemperatur an die Labore geschickt.

#RNA-Tests

Um die RNAshells® zu verwenden, haben wir sie mit einem speziellen Werkzeug geöffnet und Wasser hinzugefügt, um die RNA zu rehydrieren. Nach kurzem Warten war die RNA bereit für Tests mit RT-qPCR oder RT-LAMP-Methoden.

Wir haben auch Standard-RNA-Proben vorbereitet, die an Bordeaux CHU geschickt wurden. Diese Proben wurden mit der rehydrierten RNA aus den Kapseln verglichen.

#Kontaminationskontrolle

Um DNA-Kontamination in den RNA-Proben zu überprüfen, wurden Tests ohne die umkehrende Transkriptase durchgeführt. Diese Tests fanden eine leichte DNA-Kontamination in einer RNA-Probe, aber es war nicht genug, um die Ergebnisse zu beeinflussen.

#RT-qPCR-Analyse

Alle Kontrollproben haben positiv getestet. Die Amplifikationssignale waren unter verschiedenen RNA-Varianten konsistent. Die Unterschiede in den Ergebnissen waren hauptsächlich auf Variationen in den spezifischen Genzielen zurückzuführen, die getestet wurden.

#RNA-Stabilitätstest

Um zu bestätigen, dass die Verkapselung die RNA nicht schädigt und sie lange halten kann, haben wir verkapselte Proben getestet, die erhitzt wurden. Alle Proben funktionierten weiterhin gut und zeigten, dass sie bei Raumtemperatur ohne Wirksamkeitsverlust gelagert werden können.

Wir haben auch die Stabilität der verkapselten RNA über drei Jahre bei Raumtemperatur im Vergleich zu Proben getestet, die gefroren gehalten wurden. Die Ergebnisse zeigten keine signifikanten Unterschiede in der RNA-Stabilität.

#Kompatibilitätstest

Um sicherzustellen, dass die Kontrollen mit verschiedenen Testmethoden verwendet werden können, haben wir Kapseln an Labore geschickt, die verschiedene RT-PCR-Techniken verwenden. Die Ergebnisse waren konsistent und zeigten, dass die Kontrollen in verschiedenen Systemen gut funktionierten.

Ähnlich wurde die RNA in einem RT-LAMP-Verfahren getestet, das ebenfalls erfolgreiche Ergebnisse zeigte.

#Anwendung der Kontrollen in der Praxis

Für den Einsatz in der realen Welt wurde die verkapselte RNA als positiver Kontrolltest bei Feldtests verwendet. Sie wurde in vielen Tests an verschiedenen Standorten verwendet und hat jedes Mal gut funktioniert.

Ein privates klinisches Labor war ebenfalls beteiligt. Sie erhielten die Kapseln sowie Anweisungen zur Verwendung. Die Ergebnisse zeigten, dass die verkapselten RNA-Kontrollen gut funktionierten, obwohl zwei Proben Variabilität aufwiesen, die durch ein falsches Wasser-Mengenverhältnis während der Rehydrierung verursacht wurde.

#Fazit

Diese Studie hatte zum Ziel zu beweisen, dass verkapselte RNA-Kontrollen nützlich sind, um SARS-CoV-2 nachzuweisen. Sowohl niedrige als auch hohe RNA-Kopien waren effektiv für Tests mit RT-qPCR und RT-LAMP-Methoden. Die Kontrollen lieferten konsistente Ergebnisse in verschiedenen Laboren und wiesen auf ihre Zuverlässigkeit hin.

Darüber hinaus blieb die verkapselte RNA über 10 Jahre bei Raumtemperatur stabil. Diese Stabilität macht es einfacher, sie in verschiedenen Situationen zu verwenden, besonders wenn die Temperaturkontrolle nicht garantiert ist. Sie ist auch hilfreich für die Vorbereitung grosser Bestände, die über einen längeren Zeitraum bei Tests eingesetzt werden können.

Insgesamt vereinfacht dieser Ansatz den Einsatz interner Qualitätskontrollen in diagnostischen Verfahren und sorgt dafür, dass die Tests auch unter schwierigen Bedingungen genau und effektiv bleiben.