Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie zur Verfolgung von Listerien

Die ganze Genom-Sequenzierung ist eine mächtige Methode, um das genetische Material von Organismen, einschliesslich schädlicher Bakterien, zu analysieren. Sie ist entscheidend für das Verständnis und das Verfolgen der Verbreitung von Krankheiten, insbesondere von lebensmittelbedingten Erkrankungen, die durch Bakterien wie Listeria Monocytogenes verursacht werden. Dieses Pathogen stellt eine erhebliche Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar und kann zu schweren Krankheiten und sogar zum Tod führen.

#Die Rolle der Sequenzierungstechnologie

Öffentliche Gesundheitslabors nutzen hauptsächlich die Illumina-Kurzlesesequenzierung für ihre genetischen Studien. Eine neuere Methode namens Oxford Nanopore Technology (ONT) hat jedoch Aufmerksamkeit erregt. ONT bietet einige Vorteile, wie kostengünstiger zu sein, einfacher in der Handhabung und Ergebnisse in Echtzeit zu liefern. Es liefert auch längere Stücke genetischer Daten, die hilfreich sein können, um Gene zu identifizieren, die für Bakterienstämme wichtig sind.

Trotz dieser Vorteile hatte ONT mit Herausforderungen zu kämpfen, insbesondere mit höheren Fehlerquoten in seinen Auslesungen. Das gilt besonders für bestimmte Regionen der bakteriellen DNA, die als Homopolymer- und methylierte Stellen bekannt sind. Eine genaue Sequenzierung ist entscheidend, um zwischen nah verwandten Bakterienstämmen zu unterscheiden, und Fehler können zu falschen Schlussfolgerungen über deren Verwandtschaft führen.

Kürzlich gab es Verbesserungen der ONT-Technologie, die sie zuverlässiger für Studien im Bereich der öffentlichen Gesundheit machen, insbesondere bei der Verfolgung von Krankheitserregern.

#Listeria monocytogenes verstehen

Listeria monocytogenes ist eine Art von Bakterien, die in kontaminierten Lebensmitteln vorkommen. Sie kann schwere Krankheiten verursachen, insbesondere bei gefährdeten Bevölkerungsgruppen wie schwangeren Frauen, Neugeborenen, älteren Menschen und Personen mit geschwächtem Immunsystem. Daher ist es wichtig, diese Bakterien schnell zu identifizieren und zu verfolgen, um Ausbrüche zu verhindern und deren Verbreitung zu kontrollieren.

Listeria wird in vier Hauptlinien unterteilt, aber die Linien I und II sind für die öffentliche Gesundheit und Lebensmittelsicherheit am relevantesten. Verschiedene Stämme von Listeria tragen oft einzigartige genetische Merkmale, die helfen können, ihre Ursprünge und potenzielle Risiken zu identifizieren.

Eine der Abwehrmechanismen, die einige Bakterien gegen virale Angriffe haben, sind Methyltransferasen. Diese Enzyme können Methylgruppen an die DNA anheften, was die Art und Weise beeinflussen kann, wie diese DNA von Sequenzierungstechnologien gelesen und interpretiert wird. Während ONT die Erkennung dieser Modifikationen ermöglicht, können sie manchmal zu Fehlern in den Sequenzierungsdaten führen.

#Studienziel

Das Ziel der Studie war es zu bestimmen, ob ONT hochwertige Genetische Daten für Listeria monocytogenes liefern kann, die nützlich sein könnten, um nachzuvollziehen, woher Ausbrüche kommen. Um dies zu erreichen, sequenzierten die Forscher insgesamt 78 Isolate von Listeria monocytogenes, wobei sie Proben mit unterschiedlichen genetischen Merkmalen auswählten.

#Auswahl der Bakterienproben

Das Schweizerische Nationale Referenzzentrum für Enteropathogene Bakterien und Listeria sammelt und analysiert regelmässig Listeria-Isolate aus klinischen und Umweltquellen. Für diese Studie wählten Wissenschaftler 78 Proben aus, die bereits Illumina-Sequenzierungsdaten hatten, um die Ergebnisse zu vergleichen.

Diese umfassten eine vielfältige Gruppe von Isolaten, die verschiedene Linien von Listeria monocytogenes repräsentierten, mit einem Fokus auf Linien, die besonders wichtig für die Lebensmittelsicherheit sind. Bestimmte Klone, die mit Ausbrüchen in Verbindung stehen, wurden ebenfalls für eine detailliertere Analyse ihrer genetischen Zusammensetzung einbezogen.

#Wie die Sequenzierung durchgeführt wurde

Für die traditionelle Illumina-Sequenzierung isolierten die Forscher DNA aus den bakteriellen Proben mit speziellen Extraktionskits. Sie bereiteten DNA-Bibliotheken vor und führten die Sequenzierung mit einer Methode durch, die gepaarte Endlesungen für bessere Genauigkeit erzeugt.

Für die ONT-Sequenzierung wurde eine andere Extraktionsmethode verwendet, gefolgt von der Vorbereitung von Bibliotheken, die speziell für die ONT-Technologie entwickelt wurden. Diese Methode wurde mit dem Ziel abgeschlossen, eine hohe Abdeckung zu erreichen, um zuverlässige Daten sicherzustellen.

#Datenanalyse

Sobald die Sequenzierung abgeschlossen war, verarbeiteten die Forscher die Daten mit verschiedenen bioinformatischen Tools, um die genetischen Informationen zu bereinigen und zusammenzustellen. Dieser Schritt beinhaltete das Entfernen von Daten mit niedriger Qualität und das Organisieren der Sequenzen in vollständige Assemblierungen für die Analyse.

Für die ONT-Daten wurden mehrere Ansätze unternommen, um die Genauigkeit sicherzustellen, einschliesslich des Vergleichs der Ergebnisse mit den Illumina-Assemblierungen. Die Forscher suchten nach Fehlern in den ONT-Daten und konzentrierten sich darauf, zwischen genauen und inkorrekten Angaben zu DNA-Sequenzen zu unterscheiden.

#Sicherstellung hoher Genauigkeit

Die Ergebnisse zeigten, dass die ONT-Assemblierungen bei ordnungsgemässer Anwendung mit den Illumina-Assemblierungen hinsichtlich der Genauigkeit übereinstimmen konnten. Durch die Verwendung spezifischer Basecalling-Modelle und Polierstrategien konnten die meisten ONT-Assemblierungen hochwertige Ergebnisse mit minimalen Fehlern liefern.

Allerdings wiesen einige niedrigere Qualitätsassemblierungen erhebliche Fehler auf, die oft mit bestimmten Gen-Sequenzen in Verbindung standen, die von der Methylierung betroffen waren. Das hebt die Herausforderung hervor, mit der Forscher konfrontiert sind, um zuverlässige genetische Daten von ONT zu erhalten, wenn bestimmte genetische Modifikationen vorhanden sind.

#Fehleranalyse und Clusterbildung

Bei der Untersuchung der Auswirkungen von Ungenauigkeiten auf die Analyse des Kern-Genoms wurde festgestellt, dass die meisten ONT-Only-Assemblierungen ihren Illumina-Gegenstücken nahe kamen. In einigen Fällen, insbesondere bei spezifischen Listeria-Klonen mit bestimmten genetischen Merkmalen, konnten jedoch Abweichungen in den Allelenaufrufen zu falschen Interpretationen der bakteriellen Verwandtschaft führen.

Zum Beispiel wiesen bestimmte Listeria-Isolate aus Nahrungsquellen, die bekannt dafür waren, basierend auf früheren Daten zu clustern, Diskrepanzen in den ONT-Daten auf. Diese Unterschiede könnten beeinflussen, wie Ausbrüche zurückverfolgt und verstanden werden, was die Bedeutung einer genauen Sequenzierung unterstreicht.

#Herausforderungen mit Methylierung

Die Studie hob auch die Probleme hervor, die durch Methylierung in Sequenzierungsdaten verursacht werden. Bakterien nutzen Methylierung oft, um sich gegen fremde DNA zu schützen, aber das kann auch die Sequenzierung erschweren. Einige Bakterien in der Studie trugen Methyltransferasen, die spezifische DNA-Sequenzen angreifen, was zu erhöhten Fehlerquoten in diesen Bereichen führte.

Die Forschung deutet darauf hin, dass bestimmte genetische Merkmale, insbesondere die, die mit Methylierung in Verbindung stehen, Herausforderungen im Sequenzierungsprozess mit sich bringen könnten. Verbesserungen der Sequenzierungstechniken oder die Nutzung modifizierter Analysemethoden könnten helfen, diese Probleme in Zukunft anzugehen.

#Fazit

Zusammenfassend hat die ONT-Sequenzierung vielversprechende Ergebnisse bei der Generierung hochwertiger genetischer Daten für Listeria monocytogenes gezeigt. Auch wenn sie nicht perfekt ist und noch Verbesserungsbedarf besteht, stellt sie einen wichtigen Fortschritt beim Verfolgen und Verhindern von bakteriellen Ausbrüchen dar. Während die Forscher weiterhin die Sequenzierungstechnologie und -methoden verfeinern, besteht die Hoffnung auf eine grössere Genauigkeit, die für die öffentliche Gesundheit und Lebensmittelsicherheit entscheidend ist.

Diese Studie betont die Bedeutung der fortlaufenden Bemühungen zur Verbesserung der Sequenzierungstechnologie und zur Bewältigung der Herausforderungen, die aus der bakteriellen Genetik entstehen. Die Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit für anhaltende Forschung und Innovation in der genomischen Epidemiologie, um unsere Fähigkeit zur Überwachung und Kontrolle von lebensmittelbedingten Krankheiten effektiv zu verbessern.