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# Biologie # Mikrobiologie

Neue Testmethode für Afrikanische Schweinepest

Ein vielversprechendes Werkzeug zur schnellen Erkennung von ASF bei Schweinen wird entwickelt.

Sekhar Kambakam, Julia Thomas, Suelee Robbe-Austerman, Karthik Shanmuganatham, Rachel Palinski

― 7 min Lesedauer


Schnellere Schnellere ASF-Erkennungsmethode für schnelle Ergebnisse. Neuer Test kombiniert RPA und CRISPR
Inhaltsverzeichnis

Afrikanische Schweinepest (ASP) ist eine Viruskrankheit, die Schweine, sowohl Haustiere als auch Wildschweine, betrifft. Diese Krankheit wird durch ein Virus verursacht, das als Afrikanisches Schweinepestvirus (ASP-Virus) bekannt ist. Es gehört zu einer Gruppe von Viren, die für ihre komplexe Struktur bekannt sind. Das ASP-Virus hat eine grosse Menge an genetischem Material, genauer gesagt Doppelstrang-DNA, und kann über 160 verschiedene Proteine produzieren, die ihm helfen, zu funktionieren.

ASP ist berüchtigt dafür, sehr ansteckend zu sein. Das bedeutet, wenn ein Schwein infiziert wird, kann es sich schnell auf andere ausbreiten, was bedeutende Probleme für Schweinezüchter verursacht. Das ASP-Virus kann von Schwein zu Schwein durch direkten Kontakt übertragen werden, aber es kann auch lange ausserhalb der Schweine überleben. Es kann in der Umwelt, in Futter, auf Geräten oder sogar auf Kleidung verweilen. Wegen dieser Tatsache kann das Virus ernsthafte Sorgen für die Schweinefleischindustrie weltweit verursachen.

Infizierte Schweine können verschiedene Symptome zeigen. Sie entwickeln oft hohes Fieber und können lethargisch werden, ihren Appetit verlieren, Erbrechen, Durchfall haben und sogar unter Blutungen und Atembeschwerden leiden. In schweren Fällen kann es schnell zu einem Tod der Schweine kommen, manchmal innerhalb einer Woche, und die Sterblichkeitsrate kann bis zu 100% betragen.

Ursprünge und Verbreitung von ASP

Man nimmt an, dass ASP in Subsahara-Afrika ihren Anfang genommen hat, wo das Virus immer noch unter den lokalen Schweinepopulationen vorhanden ist. Im Laufe der Jahre gab es Ausbrüche in Europa und Amerika, obwohl viele von ihnen letztendlich eingedämmt wurden.

Ein erheblicher Ausbruch fand 2007 in Georgien statt, was dazu führte, dass das Virus unter den Wildschweinen in Osteuropa weit verbreitet wurde. Mehr als ein Jahrzehnt blieb ASP ziemlich eingekapselt, bis Biosecurity-Massnahmen gebrochen wurden, was eine schnelle Ausbreitung nach China im Jahr 2018 ermöglichte. Dieser Ausbruch hatte dramatische Auswirkungen und führte zum Zusammenbruch der Schweinehaltungsindustrie des Landes.

2021 wurde das Virus auf der Karibikinsel Hispaniola entdeckt, und dieser Ausbruch ist immer noch im Gange, was Bedenken für Länder wie die Vereinigten Staaten aufwirft. Um dieser Bedrohung entgegenzuwirken, hat die USA ihre Bemühungen zur Überwachung und Kontrolle von ASP verstärkt. Sie haben strenge Massnahmen umgesetzt, um die Bewegung von Schweinefleisch und verwandten Produkten aus betroffenen Gebieten zu verhindern, in der Hoffnung, ihre heimische Schweinepopulation zu schützen.

Der Bedarf an effektiver Diagnose

Angesichts der schwerwiegenden Auswirkungen von ASP ist eine schnelle und genaue Erkennung entscheidend. Traditionelle Methoden wie QPCR (quantitative Polymerase-Kettenreaktion) sind derzeit der Goldstandard für die Diagnose von ASP-Virus. Allerdings erfordert qPCR teure Ausrüstung, spezielle Schulung und bestimmte Laboreinrichtungen, was die Anwendung in ressourcenarmen Gebieten unpraktisch macht.

Alternative Methoden wie RPA (Rekombinase Polymerase Amplifikation) und LAMP (Loop-vermittelte isothermale Amplifikation) wurden entwickelt, erreichen jedoch nicht die Genauigkeit von qPCR. Das ist wie der Versuch, ein schnelles Tier mit einem langsameren Netz zu fangen. Die Herausforderung besteht darin, Tests zu entwickeln, die so gut wie qPCR sind, aber einfach genug für jedermann zu bedienen, selbst in abgelegenen Gebieten.

Ein innovativer Ansatz: CRISPR-Technologie

Kürzlich hat eine neue Technik namens CRISPR in vielen Bereichen, einschliesslich Gentechnik und Medizin, für Aufsehen gesorgt. Diese Technologie hat das Potenzial, für die Diagnose von Krankheiten, einschliesslich ASP, angepasst zu werden.

Indem sie CRISPR mit RPA kombinieren, versuchen Forscher, schnellere und einfachere Tests zu entwickeln, die direkt an dem Ort eingesetzt werden können, wo Schweine gehalten werden. Dieser duale Ansatz könnte Landwirten möglicherweise helfen, Infektionen schnell zu erkennen und grössere Ausbrüche zu verhindern.

Entwicklung einer neuen Testmethode

In dieser Forschung konzentrierten sich die Wissenschaftler darauf, einen neuen Test für ASP-Virus zu entwickeln, indem sie RPA mit CRISPR-Technologie kombinierten. Zuerst wählten sie kleine RNA-Stücke aus, die dafür entworfen wurden, das ASP-Virus gezielt anzugreifen. Dazu mussten sie testen, wie effektiv diese Stücke darin waren, das Virus zu erkennen.

Nachdem sie bestätigt hatten, dass der neue Test das ASP-Virus genau identifizieren konnte, stellten sie sicher, dass er gut mit verschiedenen Proben, von Blutabstrichen bis hin zu anderen biologischen Materialien, funktionierte. Die neue Methode zielte darauf ab, Ergebnisse zu liefern, die den Ergebnissen durch traditionelle qPCR-Tests entsprachen, damit ihre Zuverlässigkeit bestätigt werden konnte.

Wie der neue Test funktioniert

Der entwickelte Test ist ein einfacher zweistufiger Prozess. Im ersten Schritt verstärkt RPA das genetische Material des Virus, wenn es in der Probe vorhanden ist. Dieser Schritt wird bei einer konstanten Temperatur durchgeführt, was es einfacher macht, ihn zu verwalten.

Nachdem das genetische Material verstärkt wurde, kommt CRISPR ins Spiel. Das CRISPR-System erkennt und kennzeichnet dann das verstärkte Virusmaterial und gibt ein fluoreszierendes Signal ab. Wenn der Test funktioniert, leuchtet das Testgebiet auf, ähnlich wie bei einer Glühbirne, die angeht, wenn du den Schalter umlegst. Dieses visuelle Signal ist besonders nützlich, da es schnelle Kontrollen ermöglicht, ohne komplizierte Laboreinrichtungen zu benötigen.

Testen der neuen Methode

Um sicherzustellen, dass der neue Test korrekt funktioniert, führten die Forscher umfassende Versuche durch. Sie bereiteten positive Kontrollproben mit ASPV-DNA vor und testeten diese zusammen mit Proben von anderen Viren, um zu bestätigen, dass die neue Methode nicht fälschlicherweise andere Virusinfektionen als ASP identifizierte.

Die Forscher bewerteten auch, wie gut die Methode unter verschiedenen Bedingungen funktionierte, einschliesslich der Verwendung verschiedener Probenarten, die bei Schweinen getestet werden könnten. Sie fügten sogar bekannte Konzentrationen von ASPV-DNA hinzu, um zu sehen, ob der Test sie zuverlässig erkennen konnte, was er auch tat.

Bewertung der Effektivität

In diesen Versuchen zeigte die neue Methode eine solide Leistung. Der Test konnte ASP-Virus sowohl unter kontrollierten Bedingungen als auch bei echten Proben von Schweinen, die verdächtigt wurden, infiziert zu sein, genau identifizieren. Die Ergebnisse gaben ein beeindruckendes Mass an Zuverlässigkeit wieder, das mit den Ergebnissen von qPCR übereinstimmte, und unterstrichen, wie nützlich diese Methode im Feld sein könnte.

Warum das wichtig ist

Die Entwicklung dieses neuen Tests ist entscheidend, da er ein wichtiges Werkzeug für Landwirte und Tierärzte bietet. Im Falle eines ASP-Ausbruchs kann ein schneller und zuverlässiger Test bei der frühzeitigen Erkennung und Kontrolle helfen. Eine schnelle Diagnose bedeutet, dass schneller gehandelt werden kann, um die Ausbreitung des Virus zu verhindern.

Diese Innovation kann besonders vorteilhaft in Gebieten sein, in denen Ressourcen und Zugang zu Laboreinrichtungen begrenzt sind. Indem sie diejenigen an der Front der Schweinehaltung stärken, könnte dieser Test dazu beitragen, die Industrie vor den verheerenden Auswirkungen der ASP zu schützen.

Fazit

Zusammenfassend stellt der Anstieg der ASP eine bedeutende Herausforderung für die Schweinehaltung weltweit dar, die die Nahrungsmittelversorgung und die wirtschaftliche Stabilität beeinflusst. Die Entwicklung einer einfachen, effektiven Testmethode, die RPA und CRISPR kombiniert, könnte die Art und Weise, wie wir mit dieser Krankheit umgehen, verändern.

Mit einem schnellen und genauen Werkzeug zur Diagnose von ASP könnten wir eine Abnahme der Ausbrüche und ein reduziertes Risiko für die Schweinepopulationen sehen. Manchmal braucht es ein bisschen Kreativität und Innovation – wie die Mischung von Wissenschaft mit einem Hauch von Humor –, um Herausforderungen zu überwinden. Wissenschaftler arbeiten stetig daran, die Ausbreitungsrate von Krankheiten zu verringern und die Welt für unsere vierbeinigen Freunde und die Landwirte, die sich um sie kümmern, sicherer zu machen.

Originalquelle

Titel: Rapid identification of African swine fever virus in diagnostic samples using CRISPR-Cas

Zusammenfassung: African Swine Fever Virus (ASFV) is a high consequence, highly transmissible pathogen affecting swine causing African Swine Fever (ASF), a devastating disease, with high mortality rates in naive populations. Due to the likelihood of significant economic impacts associated with an ASF outbreak, considerable resources have been allocated in the United States (U.S.) to safeguard the swine industry against this threat. Ongoing outbreaks of ASF in the Dominican Republic and Haiti further threaten U.S. swine due to their proximity and involvement in movement to and from North America. While surveillance programs are ongoing, there are limited point-of-care (POC) tests available during outbreaks that maintain the sensitivity and specificity standards of laboratory testing (e.g., qPCR). However, the recently developed CRISPR-Cas testing systems may provide comparable high-quality results. In a CRISPR-based diagnostic assay, CRISPR effectors can be programmed with CRISPR-RNA (crRNA) to target specific DNA or RNA. Upon target binding, the Cas enzyme undergoes collateral cleavage of nearby fluorescently quenched reporter molecules (ssDNA or ssRNA), which can be detected under blue light or a fluorescence microplate reader. Furthermore, this tool is rapid, simple, cost-effective and can be performed with inexpensive equipment. For these reasons, we sought to develop a low-cost visual detection method for ASFV by employing the recombinase polymerase amplification (RPA)-dependent CRISPR-Cas12a technique that can be utilized in the field as a point-of-care-assay. Our CRISPR-Cas12a assay demonstrated comparable sensitivity and specificity to qPCR, both visually and when quantified using a fluorescent reader. In whole blood samples from ASFV-suspect or ASFV-negative cases, the CRISPR assay achieved a sensitivity of 98.3% (102 DNA copies) and a specificity of 100%. Finally, an assessment of the reaction time constraints indicated that results can be visualized in as little as seven minutes with a peak fluorescence at 40 min (RPA and CRISPR steps). The results of this feasibility assay validation allow for the rapid development of sensitive and specific POC tests that may be used for outbreak response in the future.

Autoren: Sekhar Kambakam, Julia Thomas, Suelee Robbe-Austerman, Karthik Shanmuganatham, Rachel Palinski

Letzte Aktualisierung: 2024-12-30 00:00:00

Sprache: English

Quell-URL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.27.630508

Quell-PDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.27.630508.full.pdf

Lizenz: https://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/

Änderungen: Diese Zusammenfassung wurde mit Unterstützung von AI erstellt und kann Ungenauigkeiten enthalten. Genaue Informationen entnehmen Sie bitte den hier verlinkten Originaldokumenten.

Vielen Dank an biorxiv für die Nutzung seiner Open-Access-Interoperabilität.

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