Nova-ST: Avançando Técnicas de Transcriptômica Espacial

A Transcriptômica Espacial é um método usado pra estudar tecidos, analisando as localizações e quantidades de RNA neles. Essa técnica ajuda os cientistas a entenderem como as células estão organizadas e como elas interagem umas com as outras, tanto em estados saudáveis quanto doentes. Compreendendo esses detalhes, os pesquisadores conseguem ter uma visão melhor de vários processos biológicos.

#Técnicas Atuais em Transcriptômica Espacial

Vários métodos foram desenvolvidos pra medir RNA em tecidos. Um jeito comum é a imagem multiplexada in situ, que olha a expressão de genes específicos diretamente no tecido. Porém, esse método pode ser complicado e precisa de painéis de genes pré-selecionados.

Outro método envolve matrizes de oligonucleotídeos, que são mais fáceis de implementar e permitem uma análise imparcial de todo RNA em uma amostra de tecido. Uma opção popular é o método de Transcriptômica Espacial da 10X Genomics, que fornece sequenciamento de RNA em áreas amplas, mas costuma ter limitações na resolução espacial.

Recentemente, novos métodos usando matrizes com padrões especiais surgiram, prometendo melhor resolução e a capacidade de capturar RNA de células individuais. Por exemplo, o Stereo-seq usa nanobolas de DNA dispostas em uma superfície padronizada pra alcançar esse objetivo. A abordagem Seq-Scope utiliza uma célula de fluxo Illumina modificada pra sequenciamento espacial de RNA.

Apesar desses avanços, muitos métodos atuais têm dificuldade em atingir resolução de célula única e cobrir grandes áreas de tecido.

#Introdução do Nova-ST

Junto com as técnicas existentes, uma nova plataforma chamada Nova-ST foi desenvolvida. Esse método é projetado pra realizar transcriptômica espacial de forma eficaz em grandes amostras de tecido, além de ser econômico e fácil de usar. Os chips Nova-ST são feitos de células de fluxo padronizadas de alta densidade, que capturam RNA dos tecidos com precisão aprimorada.

Depois de revisar várias opções de células de fluxo, as células de fluxo NovaSeq 6000 S4 foram escolhidas pra plataforma Nova-ST. Essa escolha permite uma área maior de sequenciamento espacial, maximizando a quantidade de dados que pode ser capturada de uma única amostra de tecido.

#Preparando os Chips Nova-ST

Pra criar os chips Nova-ST, um processo estruturado é seguido. As células de fluxo são padronizadas com pequenos poços que podem capturar RNA. A padronização é vantajosa porque oferece maior densidade e minimiza interferências entre os sinais.

Inicialmente, as células de fluxo passam por um processo chamado Indexação Molecular de Alta Densidade (HDMI) pra prepará-las para captura de RNA. Esse processo gera identificadores únicos pra cada ponto na célula de fluxo, permitindo rastrear com precisão de onde cada molécula de RNA se origina.

Em seguida, as células de fluxo passam por tratamentos enzimáticos pra se preparar pra captura de RNA. Esses tratamentos garantem que os locais de captura estejam prontos pra receber RNA do tecido.

As células de fluxo são então cortadas em chips Nova-ST menores. Existem dois métodos pra isso: uma técnica manual usando ferramentas especializadas e um método automatizado usando uma máquina de corte. O método automatizado é considerado mais confiável, produzindo chips consistentes com dano mínimo.

#Realizando Transcriptômica Espacial com Nova-ST

Pra avaliar os chips Nova-ST, os pesquisadores os aplicaram em seções frescas e congeladas de tecido cerebral de camundongo. O tecido é colocado na área funcional do chip, seguido da coloração H&E pra ajudar na registro do tecido pra alinhamento dos dados.

O processo de captura de RNA envolve várias etapas. Primeiro, o tecido é permeabilizado pra permitir que o RNA entre nos poços. Uma vez que o RNA é capturado, a transcrição reversa e outros processos são realizados pra preparar as amostras pra sequenciamento.

O sequenciamento gera informações sobre a posição espacial das moléculas de RNA, ajudando a mapear a Expressão Gênica ao longo do tecido.

#Desempenho e Resultados do Nova-ST

O desempenho do Nova-ST foi testado em múltiplos experimentos usando seções cerebrais de camundongos. O RNA capturado mostrou alta resolução espacial, o que significa que os dados podiam indicar claramente onde genes específicos estão expressos dentro do tecido.

A avaliação de qualidade das bibliotecas de RNA indicou que elas forneceram informações diversas sobre a expressão gênica. Além disso, resultados consistentes foram observados entre diferentes chips Nova-ST, demonstrando reprodutibilidade.

O mapeamento da expressão gênica revelou que vários marcadores estavam localizados nas regiões esperadas do cérebro, mostrando a capacidade do Nova-ST de capturar informações espaciais detalhadas. Por exemplo, o gene Ccn2 foi encontrado especificamente na área 6b do córtex.

Os dados da técnica Nova-ST mostraram alta sensibilidade, representando com precisão a presença de vários genes e seus níveis de expressão nas seções de tecido.

#Comparando Nova-ST com Tecnologias Existentes

Pra validar a eficácia do Nova-ST, ele foi comparado com outras técnicas de transcriptômica espacial, incluindo Stereo-seq e Slide-seq. Os resultados mostraram que o Nova-ST teve desempenho igual ou melhor do que esses métodos em termos de eficiência de mapeamento e sensibilidade.

Em particular, a tecnologia Nova-ST conseguiu detectar um número maior de genes e identificadores moleculares únicos (UMIs) em profundidades de sequenciamento similares. Isso significa que o Nova-ST pode fornecer informações mais detalhadas sem precisar de muitos recursos.

#Limitações e Direções Futuras

Embora o Nova-ST ofereça várias vantagens, há algumas limitações a considerar. Por exemplo, ele requer acesso ao sequenciador NovaSeq 6000, que pode não estar disponível em todos os laboratórios. No entanto, instalações podem ajudar gerando as células de fluxo com códigos de barras necessários.

Além disso, o processo de cortar os chips requer equipamentos especializados, que podem não estar acessíveis a todos. Embora o método manual seja uma opção, pode levar a inconsistências.

Outra limitação envolve o foco em sequenciamento de terminal curto. Isso significa que a análise de transcritos completos não é alcançável com o método atual. Melhorias futuras podem incorporar técnicas pra capturar dados mais abrangentes.

Uma maneira de aumentar a resolução do Nova-ST é reduzindo a espessura das seções de tecido, permitindo sinais transcricionais mais claros. Explorar técnicas pra definir melhor os limites celulares também poderia melhorar a precisão.

#Conclusão

Resumindo, o Nova-ST representa um avanço significativo na transcriptômica espacial, oferecendo uma abordagem econômica e eficiente pra estudar a expressão gênica em grandes áreas de tecido. Utilizando células de fluxo padronizadas e um fluxo de trabalho robusto, o Nova-ST fornece dados de alta qualidade enquanto mantém a sensibilidade.

À medida que o campo continua a se desenvolver, o Nova-ST tem o potencial de se tornar uma ferramenta valiosa pra pesquisadores de várias disciplinas, incluindo biologia do câncer e neurociência. A natureza de código aberto da plataforma também pode incentivar mais inovações e aplicações dentro da comunidade científica, ampliando seu escopo para análise de tecidos em larga escala.