Novos Métodos para Medir a Atividade da Neuraminidase no Vírus da Influenza B

O vírus da influenza B (IBV) é uma causa comum de surtos anuais, às vezes representando até 80% dos casos de gripe em certos anos. Essas infecções podem ter efeitos significativos na saúde e na economia. Assim como outra cepa da gripe, o vírus da influenza A (IAV), o IBV tem duas proteínas críticas na sua superfície: Hemaglutinina (HA) e Neuraminidase (NA). Essas proteínas desempenham papéis essenciais, mas opostos, em como o vírus entra e se espalha dentro das células hospedeiras. A HA ajuda o vírus a se anexar às células e a entrar nelas, enquanto a NA auxilia na liberação de novas partículas virais, cortando açúcares específicos que permitem a propagação do vírus.

Para combater o vírus, existem tratamentos que focam em bloquear a NA. Alguns medicamentos comuns são Oseltamivir (Tamiflu), Zanamivir (Relenza) e Peramivir (Rapivab). Também existem Anticorpos feitos contra a NA que podem proteger contra a gripe. Assim, a NA é um alvo promissor para a criação de novas vacinas contra o IAV e o IBV. Desenvolver essas vacinas requer um conhecimento melhor de como a NA muda ao longo do tempo e como medir com precisão a atividade dos tratamentos em humanos e animais. Embora já tenham ocorrido avanços na medição da atividade da NA para o IAV, o progresso tem sido lento para o IBV.

#Medindo a Atividade da Neuraminidase

Dois métodos amplamente utilizados para medir a atividade da NA em vírus da influenza são o ensaio de lectina ligado a enzima (ELLA) e o ensaio NA-Star/MUNANA. No método ELLA, a NA do vírus corta açúcares em uma substância chamada fetuina, permitindo a detecção usando uma proteína específica de amendoim. Esse método pode mostrar quão bem os anticorpos conseguem bloquear a NA, seja se ligando diretamente a ela ou chegando perto o suficiente para causar bloqueio através de obstrução física.

No entanto, sabe-se que os anticorpos contra a HA também podem interferir na atividade da NA por causa da proximidade deles no vírus. Portanto, o método ELLA pode medir erroneamente a interferência causada por anticorpos da HA em vez de medir apenas os anticorpos específicos da NA.

O ensaio MUNANA, por outro lado, usa uma molécula de açúcar menor que se conecta a uma substância fluorescente ou emissores de luz. Isso permite que a NA acesse seu alvo mais facilmente e diminui as chances de interferência da HA. No entanto, esse método apenas mede o bloqueio que ocorre quando os anticorpos se ligam diretamente à NA, não aqueles que causam bloqueio por estarem próximos.

Para resolver essa interferência dos anticorpos da HA, vários métodos foram sugeridos para o IAV que podem também funcionar para o IBV. Uma abordagem envolve usar proteínas de NA feitas sob medida em vez do próprio vírus, mas isso pode ser complicado e exigir especialização. Outro método utiliza vírus com tipos de HA não humanos, que não deveriam interagir com anticorpos humanos, mas isso pode gastar tempo também. Há um método de separar as proteínas HA e NA do vírus para prevenir a interferência. Outra abordagem potencial é remover os anticorpos da HA de amostras de soro se as substâncias certas para direcionar a HA estiverem disponíveis.

#Superando a Interferência dos Anticorpos

Para avaliar o quanto os anticorpos da HA interferem na atividade da NA do IBV, várias estratégias foram testadas. Usando um detergente específico, o Triton-X 100, descobrimos que ele reduziu muito a interferência causada pelos anticorpos da HA. Esse método funciona ao desmanchar a estrutura do vírus, permitindo que a NA funcione sem ser bloqueada pelos anticorpos da HA. Além disso, uma série de proteínas de NA engenheiradas foram criadas para estudo. Essas proteínas poderiam ajudar a avaliar a atividade da NA sem a interferência da HA.

Para medir quão eficazes esses métodos foram em eliminar a interferência indesejada, testes foram realizados usando soro de humanos e animais que haviam sido tratados para eliminar anticorpos indesejados. Esses testes mostraram que, embora algum bloqueio não específico ocorresse, o Triton-X efetivamente removeu a interferência dos anticorpos da HA.

Também tentamos usar células que expressam HA para reduzir os anticorpos da HA em amostras de soro. Embora esse método tenha mostrado potencial, os resultados variaram bastante dependendo das cepas específicas de influenza testadas. Houve casos onde a remoção dos anticorpos da HA não funcionou, e em alguns testes, outros anticorpos foram removidos involuntariamente também.

#Métodos Eficazes para Medição

Nossa principal descoberta foi que usar o Triton-X 100 foi muito eficaz em remover a interferência, permitindo uma medição mais clara da atividade da NA. Ao separar a HA e a NA, os testes forneceram resultados muito mais confiáveis. Esse método foi testado em várias cepas do IBV e provou ser consistentemente útil.

O método Triton-X foi então avaliado com soro humano, focando em amostras coletadas após a vacinação. Os resultados mostraram que, quando o Triton-X foi incluído, ele eliminou principalmente a interferência indesejada. Em contraste, sem o Triton-X, alguma interferência permaneceu.

Além disso, comparamos os resultados entre o uso de vírus tratados com Triton-X e proteínas de NA engenheiradas em várias amostras. As medições estavam altamente correlacionadas, o que apoia o valor de ambas as técnicas para estudar a atividade da NA.

#Aprendendo sobre Mudanças Antigênicas no IBV

Ao rastrear as mudanças na NA ao longo do tempo, ganhamos novos insights sobre como o IBV se desenvolveu desde 1940. Em termos de HA, ficou claro que duas linhagens distintas surgiram: B/Victoria e B/Yamagata. No entanto, a NA não mostrou o mesmo nível de separação, indicando que não se diversificou em linhagens distintas tanto quanto a HA.

Essa falta de diversificação pode ser devido à forma como os segmentos de NA são ocasionalmente trocados entre as duas linhagens, fazendo com que suas propriedades antigênicas se misturem. Ao observar os padrões de mudança na HA e na NA, notamos que, quando uma proteína muda, a outra não necessariamente segue, indicando caminhos evolutivos distintos.

Em resumo, utilizar o método Triton-X 100 permitiu que os pesquisadores tivessem uma melhor compreensão das mudanças antigênicas do IBV, além de fornecer uma maneira confiável de medir a atividade da NA sem interferência dos anticorpos. Os resultados destacam a necessidade de estudos mais detalhados e mapeamento tanto da HA quanto da NA para compreender completamente a dinâmica do IBV e seu impacto na saúde ao longo dos anos.

Com métodos de teste aprimorados, os pesquisadores podem estudar ainda mais a evolução do vírus da gripe e encontrar maneiras melhores de combater infecções, levando a vacinas e tratamentos melhorados no futuro.