Avanços em Estudos de Interação RNA-Proteína
Novos métodos melhoram a detecção de interações RNA-proteína em bactérias.
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Índice
As interações entre RNA e proteínas são super importantes pra controlar como os genes funcionam em todos os seres vivos. Nas bactérias, proteínas especiais chamadas proteínas ligadoras de RNA (RBPs) têm um papel chave na gestão da estabilidade e funções dos RNAs pequenos (sRNAs) e RNAs mensageiros (mRNAs). Entender como essas proteínas interagem com RNA é crucial pra entender a regulação gênica.
Uma RBP bacteriana bem conhecida é a Hfq, que ajuda a conectar sRNAs com as partes do mRNA que não codificam proteínas, conhecidas como regiões não traduzidas (UTRs). Essa conexão é essencial pro funcionamento certo dos ribossomos, a maquininha que lê o mRNA e faz proteínas, assim como pra degradação de RNA, que é o processo de quebrar moléculas de RNA quando elas não são mais necessárias.
Apesar do progresso em entender como a Hfq funciona, ainda tem muitas perguntas sem resposta sobre como outras RBPs interagem com RNA, como essas proteínas variam entre diferentes espécies bacterianas, e quais outras RBPs desconhecidas podem estar envolvidas.
O Assay Bacteriano Três-Híbrido (B3H)
Pra aprender mais sobre essas interações, os cientistas criaram um método chamado assay bacteriano três-híbrido (B3H). Essa técnica permite que os pesquisadores estudem interações entre RNA e proteína diretamente em células vivas de E. coli, sem precisar purificar as moléculas primeiro.
Nesse sistema, RNAs e proteínas híbridas são criados dentro das células, o que ajuda a manter condições naturais pra interações. O método B3H envolve três componentes principais: um RNA "isca", uma proteína "presa" e um adaptador que ajuda a juntá-los. Quando o RNA isca interage com a proteína presa, isso resulta em um aumento na atividade de um gene repórter, que pode ser medido.
Limitações Atuais do Assay B3H
Embora o assay B3H tenha um grande potencial, sua eficácia tem sido limitada por uma taxa modesta de sucesso na detecção de interações conhecidas entre RNA e proteína. Apesar das melhorias feitas pra aumentar o sinal de certas interações, muitas conexões bem estabelecidas entre a Hfq e seus sRNAs parceiros ainda não foram detectadas.
Além disso, o assay B3H tem se concentrado principalmente em detectar interações envolvendo moléculas de RNA que têm seus próprios sinais de terminação, enquanto muitas interações importantes envolvendo UTRs - regiões do mRNA que não codificam proteínas - foram deixadas de lado.
Um desafio do assay B3H é que o RNA de interesse precisa ser expresso como um RNA híbrido, o que às vezes pode levar ao dobramento incorreto devido à presença de elementos adicionais, como o adaptador. Estudos anteriores em um sistema semelhante usado em leveduras mostraram que adicionar sequências específicas conhecidas como clamps de GC pode ajudar a manter a forma correta das moléculas de RNA e melhorar as chances de interações bem-sucedidas.
Melhorando o Assay B3H com Clamps de GC
Baseados nos estudos com leveduras, os pesquisadores projetaram novas construções pro assay B3H que incorporam clamps de GC. Essas construções visam aprimorar a detecção de interações entre RNA e proteína, melhorando a estabilidade do dobramento dos RNAs híbridos.
Ao testar essas novas construções isca, os pesquisadores descobriram que clamps de GC mais curtos, variando de 5 a 7 pares de bases, eram mais eficazes do que clamps mais longos em melhorar os sinais de interação. A introdução desses clamps mais curtos mostrou um aumento considerável na detecção de várias Interações RNA-proteína no sistema B3H.
Expandindo Interações Detectáveis
Após desenvolver construções de isca aprimoradas com clamps de GC, os pesquisadores quiseram explorar uma gama mais ampla de interações entre RNA e proteína. Eles selecionaram uma variedade de sRNAs e 5′UTRs conhecidos por se ligarem à Hfq em estudos anteriores. Usando as novas construções 5GC pBait, eles descobriram que várias interações fracas ou indetectáveis se tornaram bem mais aparentes.
Essa expansão nas interações detectáveis é crucial pra entender como diferentes RNAs funcionam dentro da célula bacteriana. Isso indica que usar as novas construções pode levar a novas descobertas sobre as conexões RNA-proteína.
Combinando Construções pra RNA Sem Sinais de Terminação
Os pesquisadores também trabalharam em desenvolver construções que permitiriam a expressão de fragmentos de RNA que não fornecem seus próprios sinais de terminação. Esses incluíam UTRs e fragmentos de mRNA de várias espécies.
Pra gerenciar esses tipos de RNA não-terminantes, eles adicionaram um sinal de terminação intrínseco abaixo da sequência de RNA nas construções pBait. Essa modificação é essencial pra criar RNAs híbridos estáveis e garantir interações bem-sucedidas com RBPs como a Hfq.
Testando Novas Construções com 5′UTRs
A eficácia dessas novas construções foi avaliada usando várias 5′UTRs bem conhecidas que interagem com a Hfq. Os resultados mostraram que a introdução de clamps curtos de GC melhorou significativamente a detecção dessas interações, permitindo o estudo de fragmentos de RNA que haviam sido anteriormente ignorados.
De modo geral, embora algumas interações continuassem fracas, as novas construções com clamps de GC marcaram um avanço na ampliação das interações observáveis entre RNA e proteína dentro do assay B3H.
Conclusão
O desenvolvimento de novas construções pBait que incorporam clamps curtos de GC mostrou grande promessa em melhorar o assay bacteriano três-híbrido. Essas construções não só aumentam a detecção de interações conhecidas, mas também permitem a exploração de uma gama mais ampla de conexões RNA-proteína. Esse progresso pode levar a uma compreensão mais profunda da regulação gênica em bactérias e ampliar nosso conhecimento de como esses processos funcionam em nível molecular.
À medida que a pesquisa continua, esses avanços provavelmente contribuirão pra encontrar novas proteínas ligadoras de RNA e entender seus papéis na expressão gênica. O assay B3H, com suas construções aprimoradas, pode se tornar uma ferramenta valiosa no estudo das interações entre RNA e proteína, abrindo portas pra novas descobertas em genética microbiana e regulação.
Título: Improved constructs for bait RNA display in a bacterial three-hybrid assay
Resumo: We have previously developed a transcription-based bacterial three-hybrid (B3H) assay as a genetic approach to probe RNA-protein interactions inside of E. coli cells. This system offers a straightforward path to identify and assess the consequences of mutations in RBPs with molecular phenotypes of interest. One limiting factor in detecting RNA-protein interactions in the B3H assay is RNA misfolding arising from incorrect base-pair interactions with neighboring RNA sequences in a hybrid RNA. To support correct folding of hybrid bait RNAs, we have explored the use of a highly stable stem ("GC clamp") to isolate regions of a hybrid RNA as discrete folding units. In this work, we introduce new bait RNA constructs to 1) insulate the folding of individual components of the hybrid RNA with GC clamps and 2) express bait RNAs that do not encode their own intrinsic terminator. We find that short GC clamps (5 or 7 bp long) are more effective than a longer 13bp GC clamp in the B3H assay. These new constructs increase the number of Hfq-sRNA and -5'UTR interactions that are detectable in the B3H system and improve the signal-to-noise ratio of many of these interactions. We therefore recommend the use of constructs containing short GC clamps for the expression of future B3H bait RNAs. With these new constructs, a broader range of RNA-protein interactions are detectable in the B3H assay, expanding the utility and impact of this genetic tool as a platform to search for and interrogate mechanisms of additional RNA-protein interactions.
Autores: Katherine E Berry, L. D. Nguyen, H. LeBlanc
Última atualização: 2024-07-23 00:00:00
Idioma: English
Fonte URL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.07.23.604302
Fonte PDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.07.23.604302.full.pdf
Licença: https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
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