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Avanços em Sistemas de Produção de Proteínas Sem Células

Um novo sistema de diálise melhora os rendimentos de proteínas em configurações sem células.

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Sistemas sem células são montagens que permitem que cientistas criem proteínas sem usar células vivas. Esses sistemas são úteis por várias razões, como a flexibilidade e a capacidade de controlar o ambiente onde as proteínas são feitas. Eles vêm em dois tipos principais: sistemas baseados em lisados, que usam materiais celulares extraídos, e sistemas totalmente recombinantes como o PURE.

Desafios dos Sistemas Sem Células Atuais

Embora os sistemas sem células ofereçam vantagens, eles também têm algumas desvantagens em comparação com o uso de células inteiras para Produção de Proteínas. Um problema grande é que eles não se regeneram sozinhos, ou seja, só conseguem funcionar por um tempo limitado antes de pararem de produzir proteínas. Isso resulta em uma quantidade total de proteína feita menor. Por isso, os pesquisadores estão interessados em maneiras de aumentar o tempo que esses sistemas podem produzir proteínas para melhorar o rendimento total.

Geralmente, existem duas maneiras principais de melhorar o rendimento de proteínas nesses sistemas. A primeira é ajustar a mistura de ingredientes usados no próprio sistema. A segunda é fornecer componentes extras para manter a reação acontecendo por mais tempo, como fontes de energia e blocos de construção menores necessários para a criação de proteínas.

Diferenças Entre Sistemas de Lisado e PURE

Sistemas de lisado tendem a produzir mais proteína do que sistemas PURE. No entanto, como o lisado depende de materiais retirados de células, pode ser inconsistente entre lotes, causando variações nos resultados. Por outro lado, sistemas PURE são feitos de componentes criados separadamente, tornando-os mais confiáveis para várias aplicações, incluindo biologia sintética e terapias médicas.

O melhor rendimento de proteína alcançado em sistemas sem células até agora foi de 8 mg/mL usando uma forma especial de lisado contida em estruturas pequenas e seladas chamadas lipossomos. Esse método não só aumentou a quantidade de proteína, mas também permitiu que a produção continuasse por 20 horas. O melhor rendimento de um sistema PURE, no entanto, foi reportado há uma década em 3.8 mg/mL, usando um método envolvendo Diálise, que é uma forma de separar moléculas menores das maiores.

Outros métodos para manter a produção de proteína por mais tempo envolvem prender ou enclausurar as proteínas em materiais especiais. Alguns experimentos mostraram que é possível produzir proteínas por até 16 dias usando sistemas PURE e até mais tempo para sistemas de lisado. Porém, esses métodos podem ser complexos e trabalhosos, resultando muitas vezes em rendimentos menores.

Um Novo Sistema de Diálise Simples

Os pesquisadores desenvolveram agora um sistema de diálise simples projetado para produzir proteínas em pequenos volumes (100 µL). Essa montagem pode ser criada usando peças facilmente disponíveis e pode funcionar com equipamentos de laboratório padrão. Os principais benefícios desse novo sistema incluem fácil acesso às áreas de reação durante o processo, facilitando a adição de mais Nutrientes e o acompanhamento do que está acontecendo em tempo real usando leitores de placas fluorescentes comuns.

Nos testes, esse novo sistema de diálise permitiu que a produção de proteínas continuasse por quatro dias e, com adições regulares de nutrientes, se estendeu até 12.5 dias, resultando em 1.15 mg/mL de proteína. Esse resultado marca o tempo de produção mais longo para um sistema PURE que não usou métodos de encapsulação.

Como Funciona o Sistema de Diálise

O novo sistema usa uma placa de 24 poços como base. Cada poço tem uma câmara de diálise que inclui um compartimento de alimentação e uma câmara de reação. Os copos de diálise selecionados para essas câmaras têm um filtro especial que permite que moléculas menores passem, prevenindo que proteínas maiores escapem. Ao cortar esses copos com cuidado e colocá-los na placa, os pesquisadores puderam montar 24 reações ao mesmo tempo.

Quando chegou a hora de monitorar e manter o sistema, os pesquisadores conseguiram facilmente refrescar a solução de alimentação removendo a vedação da placa e substituindo a solução velha por uma nova. Esse design mantém o ambiente de produção de proteínas estável enquanto permite ajustes.

Testando o Novo Sistema

Nos testes comparando a produção de proteína em sistemas de lisado e PURE usando o novo sistema de diálise, foi descoberto que a produção de proteína do lisado para. em menos de um dia, enquanto o PURE pode continuar por cerca de quatro dias. O rendimento total de proteína foi maior para o PURE, que produziu aproximadamente 25.300 unidades relativas de fluorescência (RFU), em comparação com 19.200 RFU para o lisado.

Para ver se a substituição regular de nutrientes poderia aumentar a produção de proteína, os pesquisadores adicionaram soluções de alimentação frescas a cada três ou quatro dias. Essa abordagem permitiu que a produção de proteínas PURE continuasse por 12.5 dias, estendendo significativamente o tempo ativo de produção. Em contraste, as reações do lisado não se beneficiaram muito dessa reposição, pois sua produção de proteína parou cedo.

Resultados de Rendimento de Proteínas

O rendimento total de proteínas produzidas em cada teste foi medido usando um método padrão que envolve comparar as leituras fluorescentes a concentrações conhecidas. As reações PURE renderam 0.43 e 0.32 mg/mL sem reposição, enquanto com a solução de alimentação fresca adicionada, o rendimento aumentou para cerca de 1.05 e 1.16 mg/mL. O rendimento das reações de lisado foi menor, variando entre 0.24 e 0.36 mg/mL, mesmo com a reposição de nutrientes.

Usando esse novo sistema de diálise, os pesquisadores melhoraram significativamente a eficiência da produção de proteínas no sistema PURE em comparação com métodos anteriores sem diálise. O rendimento alcançado foi cerca de cinco vezes maior que os resultados anteriores.

Conclusões e Aplicações Futuras

Neste trabalho, foi introduzido um sistema simples, mas eficaz, para produzir proteínas sem células, usando diálise para estender o tempo de produção. Os experimentos demonstraram que o novo sistema pode manter a produção de proteínas por 12.5 dias, uma melhoria substancial em relação aos métodos anteriores. Isso pode ser valioso em várias áreas, incluindo a criação de terapias e o desenvolvimento de sistemas para monitorar ambientes ou diagnosticar condições.

O design simples significa que muitos laboratórios podem adotar facilmente esse sistema, potencialmente levando a avanços em como as proteínas são produzidas para várias aplicações. Pesquisas futuras podem se concentrar em melhorar ainda mais o rendimento de proteínas testando diferentes combinações de ingredientes e condições para reduzir problemas como aglomeração de proteínas ou degradação, especialmente em sistemas de lisado. No geral, esse desenvolvimento mostra o potencial dos sistemas sem células e seu papel em futuros estudos científicos e aplicações industriais.

Fonte original

Título: Long-term protein synthesis with PURE in a mesoscale dialysis system

Resumo: Cell-free systems are powerful tools in synthetic biology with versatile and wide-ranging applications. However, a significant bottleneck for these systems, particularly the PURE cell-free system, is their limited reaction lifespan and yield. Dialysis offers a promising approach to prolong reaction lifetimes and increase yields, yet most custom dialysis systems require access to sophisticated equipment like 3D printers or microfabrication tools. In this study, we utilized an easy-to-assemble, medium-scale dialysis system for cell-free reactions using commercially available components. By employing dialysis with periodic exchange of the feeding solution, we achieved a protein yield of 1.16 mg/mL GFP in the PURE system and extended protein synthesis for at least 12.5 consecutive days, demonstrating the systems excellent stability.

Autores: Sebastian Josef Maerkl, L. R. Julia, L. Grasemann, F. Stellacci

Última atualização: 2024-09-09 00:00:00

Idioma: English

Fonte URL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.09.09.611992

Fonte PDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.09.09.611992.full.pdf

Licença: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Alterações: Este resumo foi elaborado com a assistência da AI e pode conter imprecisões. Para obter informações exactas, consulte os documentos originais ligados aqui.

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