Abordando Contaminantes na Purificação de Proteínas

A purificação de proteínas é uma etapa importante em muitos experimentos científicos. Ela serve pra separar proteínas específicas de outras substâncias em uma solução. Esse processo é fundamental pra estudar proteínas, desenvolver medicamentos e explorar processos bioquímicos. Mas, tem uns desafios na purificação de proteínas, especialmente quando proteínas indesejadas de fontes desconhecidas também são isoladas. Esse problema pode dificultar o estudo das proteínas de interesse.

Neste artigo, vamos falar sobre um caso em que enfrentamos um problema durante a purificação de um novo tipo de nanopartícula feita de proteínas. Encontramos uma proteína não identificada que estava se purificando junto com nossa nanopartícula-alvo. Essa proteína contaminante estava presente em várias amostras com as quais estávamos trabalhando, por isso era importante descobrir o que era. Usamos técnicas de imagem avançadas e ferramentas de computador pra ajudar a identificar o contaminante e melhorar nosso método de purificação.

#Contexto

A purificação de proteínas é uma técnica comum usada em várias áreas da pesquisa, incluindo bioquímica e biologia molecular. O objetivo é isolar uma proteína específica ou um grupo de proteínas de uma mistura pra que possam ser estudadas em detalhes. Isso pode envolver várias etapas, incluindo a isolação inicial, separação com base em tamanho ou carga, e purificação adicional pra alcançar o nível de pureza desejado.

No nosso caso específico, estávamos trabalhando com uma nanopartícula de dois componentes projetada. Esse tipo de nanopartícula é criado combinando duas proteínas diferentes que foram engenheiradas pra se montar de uma certa forma. A nanopartícula que queríamos produzir tinha uma estrutura específica que era crítica pra sua função pretendida.

#O Desafio

Durante nossos esforços de purificação, percebemos que uma proteína menor estava aparecendo junto com nossa nanopartícula-alvo. Essa proteína contaminante não estava apenas presente na amostra atual, mas também em várias outras amostras do nosso laboratório. A presença dessa proteína indesejada dificultou a determinação da quantidade e pureza da nossa nanopartícula projetada.

No começo, não sabíamos se esse contaminante era um produto do nosso processo de design, um resultado de contaminação de outras amostras, ou uma proteína que ocorria naturalmente das bactérias que estávamos usando pra expressar nossas proteínas. Pra resolver esse problema, sabíamos que precisávamos identificar a proteína contaminante e refinar nosso processo de purificação.

#Técnicas Usadas pra Identificação

Pra identificar a proteína desconhecida, utilizamos duas técnicas avançadas: Microscopia eletrônica crio (Cryo-EM) e uma ferramenta de aprendizado de máquina chamada ModelAngelo.

A Cryo-EM é uma técnica poderosa de imagem que permite que os pesquisadores vejam proteínas em altíssimas resoluções. Ela envolve congelar rapidamente as amostras de proteínas e depois tirar milhares de imagens. Analisando essas imagens, conseguimos ter uma ideia clara da estrutura da proteína.

ModelAngelo, por outro lado, é uma ferramenta de software que usa aprendizado profundo pra ajudar a construir modelos atômicos de proteínas com base nos dados estruturais disponíveis. Ela pode analisar os mapas de densidade gerados a partir das imagens de Cryo-EM e construir modelos que representam a estrutura da proteína.

Combinando essas duas técnicas, conseguimos obter insights sobre a estrutura da proteína contaminante. Processamos nossos dados de Cryo-EM e usamos ModelAngelo pra ajudar a construir modelos que poderiam representar tanto nossa nanopartícula projetada quanto a proteína contaminante.

#Observação do Contaminante

Quando começamos nossa análise, descobrimos que a proteína contaminante aparecia como uma partícula menor com uma forma octaédrica, semelhante à nossa nanopartícula projetada. Isso foi surpreendente, já que nosso design tinha como alvo uma arquitetura específica que era mais complexa.

Fizemos uma análise detalhada e comparamos os tamanhos e formas das partículas que observamos sob o microscópio. A nanopartícula projetada tinha uma massa e tamanho previstos que eram muito maiores que a proteína contaminante. Essa diferença possibilitou distinguir entre elas nas nossas amostras.

Apesar dos nossos esforços, a proteína contaminante constituía uma grande proporção do que isolamos durante a purificação. Isso afetou significativamente nosso rendimento e pureza, tornando as análises e caracterizações subsequentes pouco confiáveis.

#Identificando o Contaminante

Pra identificar corretamente a proteína contaminante desconhecida, realizamos vários experimentos usando os dados que coletamos da Cryo-EM. Depois de gerar os mapas de densidade, usamos ModelAngelo pra gerar fragmentos de sequência que correspondessem à densidade que observamos.

A saída do ModelAngelo revelou várias sequências potenciais pra proteína contaminante. Depois, usamos uma ferramenta chamada Protein BLAST pra comparar essas sequências com um banco de dados de proteínas conhecidas pra encontrar correspondências. Curiosamente, descobrimos que um grande número dos melhores resultados correspondia a uma proteína chamada dihidrolipomato succiniltransferase (DLST). Essa proteína é conhecida por ser um contaminante comum em amostras derivadas de bactérias usadas em engenharia genética.

#Revisando o Protocolo de Purificação

Com a identificação da DLST como o contaminante, precisávamos desenvolver um protocolo de purificação revisado pra eliminá-la das nossas amostras. Pesquisas anteriores mostraram que a DLST poderia se co-purificar com muitas proteínas, mas as razões pra essa co-eluição não eram claras. Começamos explorando a possibilidade de que as propriedades de superfície da DLST poderiam contribuir pra sua interação com a resina usada no processo de purificação.

Uma hipótese era que a DLST contém resíduos de histidina em sua superfície, que poderiam se ligar aos íons de níquel na resina, levando à sua co-purificação com proteínas-alvo que também tinham tags de histidina. Pra testar essa ideia, modificamos nosso método de purificação mudando a concentração de imidazol nos nossos tampões de eluição, esperando liberar a DLST de forma mais eficaz.

Apesar dessas mudanças, ainda detectamos a DLST em nossas amostras. Então tentamos aumentar a concentração de cloreto de sódio nos nossos tampões, achando que isso poderia desestabilizar qualquer interação não específica entre a DLST e nossas proteínas-alvo. Enquanto aumentar a concentração de sal ajudou a reduzir os níveis de DLST, também diminuiu significativamente o rendimento da nossa nanopartícula projetada.

#Remoção Bem-Sucedida do Contaminante

Pra encontrar uma solução melhor, decidimos incorporar Excipientes, que são substâncias que podem melhorar as propriedades das proteínas durante a purificação. Adicionamos aminoácidos como glicina e arginina aos nossos tampões. Esses compostos são conhecidos por reduzir interações indesejadas entre proteínas e melhorar a estabilidade geral.

A adição desses excipientes aos nossos tampões de purificação levou a um resultado notável. Não só conseguimos quase eliminar a DLST de nossas amostras, mas também aumentamos significativamente o rendimento da nossa nanopartícula projetada. Isso foi um grande avanço para nosso projeto, permitindo-nos obter amostras altamente puras para análises futuras.

#Importância da Resolução da Cryo-EM

Nosso sucesso em identificar a DLST e otimizar nosso protocolo de purificação destaca a importância de dados experimentais de alta qualidade, especialmente ao usar técnicas como Cryo-EM. A resolução dos dados afeta nossa capacidade de determinar com precisão as estruturas das proteínas. No nosso caso, alcançamos uma resolução de 2.51 Å, que nos permitiu reunir detalhes suficientes pra identificar a proteína contaminante com confiança.

Curiosos sobre a aplicabilidade da nossa abordagem, testamos a eficácia do nosso fluxo de trabalho de identificação em diferentes resoluções. Processamos os mesmos dados de Cryo-EM em várias resoluções pra ver se ainda conseguiríamos identificar a DLST corretamente. Descobrimos que, mesmo em resoluções mais baixas, nosso método continuava eficaz, indicando que poderia ser benéfico em uma gama mais ampla de situações onde dados de alta qualidade podem não ser viáveis.

#Conclusão

Resumindo, a identificação e remoção da proteína contaminante DLST das nossas amostras de nanopartículas foram passos críticos pra melhorar nosso processo de purificação e garantir a qualidade dos nossos experimentos. Ao aproveitar técnicas avançadas de imagem e ferramentas computacionais, conseguimos transformar uma situação desafiadora em uma oportunidade de refinamento e otimização.

Nossa experiência enfatiza a importância de entender bem as técnicas de purificação de proteínas e os desafios que podem surgir. A integração de novas tecnologias, como Cryo-EM e ferramentas de aprendizado de máquina, oferece aos pesquisadores meios poderosos pra lidar com complexidades na purificação de proteínas, aprimorando nossa capacidade de estudar e utilizar proteínas para várias aplicações.

A aplicação bem-sucedida do nosso protocolo de purificação refinado não apenas melhorou nosso trabalho, mas também abriu portas pra estudos futuros sobre nossas nanopartículas projetadas de dois componentes. Os métodos desenvolvidos podem servir como um modelo pra outros pesquisadores enfrentando desafios semelhantes na purificação e caracterização de proteínas.