Como a Pausa da Polimerase Afeta a Expressão Gênica

Fatores de Transcrição (TFs) são proteínas que ajudam a controlar o processo de expressão gênica, se ligando a partes específicas do DNA. Quando eles se ligam ao DNA, trazem outras proteínas e ferramentas necessárias para fazer RNA, que é um passo importante para colocar as instruções dos genes em ação. Às vezes, a maquinaria que faz RNA (conhecida como RNA Polimerase) para logo após começar o processo, e isso pode acontecer em cerca de 30-50% dos genes. Essa pausa acontece perto do ponto de partida do gene e pode desacelerar o processo geral de produção de RNA.

#O Papel da Pausa da Polimerase

Quando a RNA polimerase pausa depois de adicionar apenas alguns blocos de construção de RNA, isso pode se tornar um gargalo na transcrição. Vários fatores, incluindo sequências de DNA e diferentes proteínas, regulam como e quando a polimerase continua a partir dessa pausa. Existem proteínas que ajudam a suavizar esse processo interagindo com a RNA polimerase ou modificando a estrutura do DNA ao redor.

Além disso, a RNA polimerase pausada pode recrutar um grupo de outras proteínas que ajudam a mudar a estrutura do DNA, criando regiões mais flexíveis. Descobertas recentes destacam um grupo específico, conhecido como complexo BAF, que ajuda a criar áreas soltas, removendo nucleossomos compactados, permitindo mais acesso a outras proteínas, incluindo os fatores de transcrição.

Enquanto a polimerase está pausada, ela ainda pode produzir pequenos trechos de RNA, que podem ser protegidos da degradação por interações específicas. Esse RNA curto permanece associado à polimerase, enquanto qualquer RNA que é liberado tende a se degradar rapidamente. Portanto, as regiões ao redor dessas polimerases pausadas são caracterizadas pela presença desses filamentos curtos de RNA e áreas livres de nucleossomos.

#Interação Entre Fatores de Transcrição e RNA

Muitos fatores de transcrição são conhecidos por se ligarem ao RNA além do DNA. Essa capacidade de se ligar ao RNA pode mudar a forma como eles grudam nos seus sites alvo de DNA. Há uma hipótese de que as regiões criadas quando a polimerase está pausada podem expor novos sites de ligação para os fatores de transcrição. Além disso, o RNA curto produzido durante a pausa pode ajudar a estabilizar a ligação desses fatores.

Um fator de transcrição específico conhecido como ERα responde ao sinal de estrogênio e também pode se ligar ao RNA. Estudos indicam que quando o processo de elongação da transcrição é inibido, a ligação do ERα a certos sites de DNA aumenta. Esse aumento na ligação está correlacionado com um tempo mais longo que o ERα permanece ligado. Além disso, se a polimerase se degrada, a ligação do ERα diminui, indicando que o RNA curto produzido é vital para manter o ERα nesses sites pausados.

#Efeitos da Inibição da Elongação da Transcrição

Para entender como a pausa da polimerase afeta a ligação do ERα, os pesquisadores usaram um remédio para inibir a elongação da transcrição. Quando trataram as células com esse remédio, perceberam um aumento na ligação do ERα ao longo do genoma. Especificamente, muitos mais eventos de ligação foram vistos onde a polimerase já estava presente antes do tratamento.

Os pesquisadores desenharam experimentos onde puderam medir com que frequência o ERα estava se ligando e quanto tempo ele ficou ligado ao DNA. Descobriram que a inibição da elongação levou a mais moléculas de ERα se ligando à cromatina, ou à forma estruturada que o DNA assume dentro da célula. O aumento na ligação dependia dos níveis de RNA polimerase já nesses locais.

#Formação de Condensados de ERα

ERα também pode formar agrupamentos conhecidos como condensados, que são grupos de moléculas que se juntam em áreas específicas, e esse fenômeno parece ser afetado pela ligação ao RNA e pelo processo de transcrição. Quando as células foram tratadas com o remédio, observaram que os agrupamentos de ERα ficaram maiores e se formaram mais rapidamente em resposta ao sinal de estrogênio.

O tamanho e número desses agrupamentos aumentaram significativamente após a adição do hormônio, mostrando que eles respondiam à atividade transcricional das células. Após o tratamento, se o tamanho do condensado mudou, isso dependia dos níveis de polimerase, sugerindo uma relação direta entre a atividade de transcrição e o agrupamento do ERα.

#Contribuição do RNA Curto

A presença de RNA curto produzido pela polimerase pausada parece ajudar na ligação do ERα. Quando os pesquisadores tentaram degradar a polimerase, encontraram uma redução nos níveis de RNA e também uma queda significativa na ligação do ERα em muitos locais do genoma. Isso indicou que o RNA curto contribuía para manter o ERα nesses locais onde estava ligado.

Para investigar mais se o RNA associado à cromatina estava melhorando a ligação do ERα, realizaram vários experimentos envolvendo a redução dos níveis de RNA enquanto monitoravam as mudanças na ligação do ERα. Descobriram que aumentar os níveis de RNA levava a uma ligação aprimorada do ERα, reforçando a ideia do papel de apoio do RNA na função dos fatores de transcrição.

#O Impacto da Acetilação das Histonas

Além das interações entre fatores de transcrição e RNA, também há modificações nas proteínas que empacotam o DNA, conhecidas como histonas, especificamente uma característica chamada acetilação H3K27. Quando eles analisaram como a polimerase pausava em áreas promotoras, descobriram que os níveis de Acetilação de Histonas aumentavam, o que corresponde a uma atividade transcricional aumentada.

Os pesquisadores descobriram que, após usar o inibidor de transcrição, não só viram níveis mais altos de ligação do ERα, mas também aumentaram as marcas de acetilação indicativas de transcrição ativa nessas regiões pausadas. A combinação de aumento nos fatores de transcrição e modificações nas histonas cria um ambiente favorável para a transcrição acontecer uma vez que a polimerase retome a partir da pausa.

#Correlação com a Atividade Transcricional

Para ver se o aumento na ligação do ERα e na acetilação H3K27 realmente leva a mais transcrição gênica, os pesquisadores monitoraram os níveis de RNA recém-formado depois que liberaram a inibição. Descobriram que as regiões onde houve aumentos notáveis na ligação do ERα e nos níveis de acetilação após o tratamento com o remédio apresentaram níveis de transcrição significativamente mais altos.

Isso indica que a presença de fatores de transcrição e modificações na cromatina tornam esses locais mais propensos a serem transcritos ativamente uma vez que a inibição da elongação foi retirada. Basicamente, essas descobertas sugerem que ter um fator de transcrição em locais pausados prepara essas áreas para uma transcrição robusta.

#Conclusão

No geral, as interações entre fatores de transcrição, RNA e modificações na cromatina desempenham um papel essencial na regulação da expressão gênica. A presença da RNA polimerase pausada serve como um ponto crítico onde os fatores de transcrição podem se ligar, estabilizar e promover a atividade transcricional. A mudança no cenário regulatório durante a pausa da polimerase cria um ambiente dinâmico que não só influencia eventos de transcrição imediatos, mas também prepara o palco para respostas transcricionais duradouras.

Através desses mecanismos intrincados, as células conseguem ajustar como os genes são expressos em resposta a vários sinais, garantindo que as atividades celulares estejam alinhadas com as necessidades fisiológicas.

#Materiais e Métodos

#Cultura Celular

As células MCF-7 foram obtidas de um centro de recursos biológicos e foram cultivadas em meio nutritivo sob controle de temperatura e níveis de dióxido de carbono.

#Estímulo de Ligantes e Tratamento com Inibidores de Transcrição

Para experimentos envolvendo estimulação de estrogênio, as células receberam um regime de tratamento específico para garantir que estivessem prontas para responder a sinais hormonais. Após uma série de lavagens e trocas de meio, as células foram tratadas com uma pequena quantidade de estrogênio.

Nos casos em que a transcrição foi inibida, as células foram tratadas com medicamentos projetados para bloquear várias etapas do processo de transcrição. Após esses tratamentos, amostras foram coletadas para analisar os efeitos nos fatores de transcrição e no RNA ligado.

#Técnicas de Análise

Para analisar as interações e eventos de ligação, técnicas como imunomarcação e precipitação de cromatina seguida de sequenciamento (ChIP-seq) foram empregadas. Isso permitiu que os pesquisadores visualizassem e quantificassem a ligação de proteínas ao DNA ao longo do genoma.

Além disso, técnicas de imagem em células vivas foram utilizadas para observar como os fatores de transcrição se comportavam em tempo real, permitindo uma melhor compreensão de suas dinâmicas em relação às atividades de transcrição.

#Análise Estatística

Os dados coletados dos experimentos foram submetidos a testes estatísticos para determinar significância e entender as relações entre várias medições, aumentando a confiança nas conclusões tiradas do trabalho.

#Informações Suplementares

Métodos detalhados adicionais sobre montagens experimentais, técnicas de análise e dados extras podem fornecer insights mais profundos sobre as descobertas e metodologias empregadas ao longo do estudo.