Avanços nas Técnicas de Expressão de Proteínas

As proteínas são partes essenciais de todos os organismos vivos. Elas desempenham papéis fundamentais em muitos processos biológicos. Entender como as proteínas funcionam e interagem entre si é importante para várias áreas da ciência, incluindo medicina e genética. Um aspecto interessante das proteínas é que elas podem formar complexos com outras proteínas. Isso é especialmente importante para descobrir como elas funcionam e como mudaram ao longo do tempo.

Nas células, muitas vezes é necessário estudar as ações e interações de vários genes ao mesmo tempo. Em organismos mais simples, como bactérias e leveduras, os cientistas conseguem expressar muitos genes facilmente usando sequências de DNA específicas chamadas de promotores. No entanto, isso pode ser complicado em organismos mais complexos. Em animais, fazer vários genes trabalharem juntos pode ser bem desafiador.

#Técnicas de Expressão Gênica

Uma forma de expressar vários genes de uma vez é usando um tipo especial de RNA mensageiro (mRNA). Esse tipo de mRNA pode carregar a informação de vários genes. Por exemplo, uma sequência chamada de Internal Ribosome Entry Site (IRES) permite a tradução de dois genes a partir de uma única fita de mRNA. No entanto, usar IRES muitas vezes resulta em uma produção menor do segundo gene em comparação com o primeiro.

Outro método avançado envolve o uso de peptídeos curtos conhecidos como peptídeos 2A. Esses peptídeos ajudam a expressar várias proteínas a partir de uma única fita de mRNA. Quando esses peptídeos são produzidos, eles interferem com o ribossomo de uma forma que permite que o sistema pule certas seções, levando à produção de várias proteínas. Esse método já mostrou funcionar para expressar até quatro genes simultaneamente, mas a eficiência diminui para cada gene adicional.

Em células de mamíferos, um sistema chamado MultiLabel pode expressar até cinco genes de uma vez. Esse sistema é baseado em um método de expressão de baculovírus usado em linhagens celulares específicas de mariposa.

#Splicing Alternativo

Outra forma que a natureza cria diversidade em proteínas é através de um processo chamado splicing alternativo. Isso permite que um único gene produza várias formas de proteínas, incluindo ou excluindo certos segmentos durante a criação do mRNA. Um exemplo bem conhecido de splicing alternativo é a molécula de adesão celular do síndrome de Down da Drosophila, ou DSCAM. O gene Dscam pode formar muitas versões diferentes da proteína devido ao seu mecanismo de splicing complexo.

Dscam contém um conjunto de éxons que podem ser selecionados de forma mutuamente exclusiva. Isso significa que durante o processo de transcrição, apenas uma versão de várias opções é incluída no mRNA final. Isso cria uma vasta variedade de potenciais produtos proteicos.

#O Sistema de Expressão de Politransgene (PXGS)

O Sistema de Expressão de Politransgene (PXGS) é um novo método que utiliza a propriedade de splicing alternativo do Dscam. Ao colocar toda a região de splicing do Dscam em um vetor de DNA, os pesquisadores podem modificá-lo para expressar qualquer gene que desejam com base nas opções de splicing disponíveis. Isso permite que os cientistas aproveitem a habilidade única do Dscam de produzir muitas proteínas diferentes.

Usando esse sistema, os pesquisadores podem manipular a expressão gênica facilmente para controlar melhor como e quando certas proteínas são feitas em uma célula. O PXGS pode permitir o estudo de mais de um gene por vez.

#Verificação do Splicing do Dscam no PXGS

Antes de usar o PXGS, era importante verificar se o splicing único do Dscam ainda funcionaria corretamente. Os cientistas realizaram testes inserindo partes do gene Dscam em uma nova construção de DNA. Eles queriam garantir que o processo de splicing permanecesse intacto ao usar um promotor específico que permite uma expressão controlada. Os resultados confirmaram que as variantes desejadas do Dscam foram produzidas como esperado.

#Proteínas Fluorescentes e Substituição Gênica

Os pesquisadores também testaram a habilidade de inserir diferentes genes na estrutura do Dscam. Ao substituir éxons específicos do Dscam por genes que produzem proteínas fluorescentes, eles puderam acompanhar onde e como essas proteínas são expressas dentro das células. Os testes iniciais mostraram que não só conseguiram substituir éxons por genes fluorescentes, mas o sistema ainda funcionava corretamente, indicando que as sequências específicas do Dscam não eram estritamente necessárias para o splicing.

#Expressão Multicolorida em Células

O sistema PXGS permite a expressão simultânea de várias proteínas fluorescentes dentro de um único tipo de célula. Nos experimentos realizados, essa configuração conseguiu expressar com sucesso quatro cores diferentes de proteínas fluorescentes para distinguir células específicas.

Ao aplicar esse método em células neuronais, os pesquisadores descobriram que a fluorescência se espalhou por todos os neurônios pretendidos, mostrando uma expressão efetiva das diferentes proteínas. No entanto, apesar de o sistema funcionar bem, eles perceberam que o brilho das cores individuais estava mais baixo do que o esperado devido à distribuição da expressão entre várias proteínas.

#Usando PXGS Além dos Neurônios

Como o Dscam é expresso em vários tecidos, não apenas em células neuronais, os pesquisadores buscaram testar o PXGS em outros tipos de células também. Eles projetaram com sucesso uma construção de PXGS multicolorida que permitiu a expressão de múltiplos fluoróforos em várias células. Ao cruzar as linhagens PXGS com diferentes impulsionadores Gal4, conseguiram rotular tanto células neurais quanto não neurais em todo o organismo.

#Expressão Funcional na Organização Tissular

Uma parte significativa do uso do PXGS foi testar se ele poderia expressar genes grandes e funcionalmente significativos. Os pesquisadores selecionaram vários receptores de superfície celular e os incorporaram na estrutura do PXGS para expressá-los de forma errada especificamente em neurônios sensoriais. Isso permitiu que eles estudassem os padrões de fiação neuronal e como esses receptores interagiam entre si in vivo.

Os resultados desses testes demonstraram que a expressão errada levou a mudanças notáveis nos padrões de crescimento e ramificação de axônios. Essas descobertas forneceram insights sobre como certos receptores influenciam o desenvolvimento e a estrutura das conexões neuronais.

#Conclusão

O Sistema de Expressão de Politransgene (PXGS) oferece uma nova abordagem promissora para estudar a expressão gênica e seus efeitos em sistemas biológicos. Ao permitir a expressão conjunta de múltiplos genes, os pesquisadores podem obter insights mais profundos sobre funções celulares, interações proteicas e processos de desenvolvimento em organismos complexos, como as moscas-da-fruta. Essa tecnologia inovadora tem potencial para ser adaptada para várias aplicações em biologia sintética e estudos de expressão gênica em diferentes espécies.