Avançando na Engenharia de Proteínas com Aminoácidos Não Canônicos

No mundo das proteínas, tem uns tijolinhos conhecidos como aminoácidos que se juntam pra formar cadeias, sendo a estrutura super importante pra como a proteína funciona. Na maioria das vezes, a gente fica nos aminoácidos tradicionais, os canônicos. Mas tem uns personagens diferentes, chamados aminoácidos não canônicos (ncAAs), que podem mudar um pouco a brincadeira. Esses ncAAs podem dar novas habilidades às proteínas ou ajudar elas a fazerem seu trabalho melhor. Os cientistas arrumaram um jeito de colocar esses ncAAs nas proteínas em células vivas, tudo graças a uma tecnologia chamada Expansão do Código Genético.

#O Básico da Expansão do Código Genético

Mas como isso tudo rola? Imagina que você tem uma receita que só permite um número limitado de ingredientes. A expansão do código genético é como adicionar uns ingredientes mais chiques na mistura. Mas pra fazer isso acontecer, os cientistas precisam de um par especial de ajudantes: uma aminoacil-tRNA sintase (aaRS) e um tRNA que não costumam andar com a galera usual das células. Esse par especial consegue reconhecer e adicionar os ncAAs desejados nas proteínas quando o sinal certo (um códon sem sentido reaproveitado) aparece.

#Encontrando o Par Certo

Pra garantir que o novo par não se confunda com os que já estão na célula, os cientistas costumam pegar eles de organismos diferentes, como bactérias, arqueias ou eucariontes. Isso significa que quando fazemos isso em bactérias, podemos pegar a aaRS de arqueias ou eucariontes, enquanto nas células eucarióticas, podemos pegar de bactérias ou arqueias. É tipo reunir ingredientes de diferentes partes do mundo pra criar um prato único!

#Expandindo o Uso da Tecnologia de GCE

Essa tecnologia evoluiu pra funcionar em células eucarióticas, incluindo células de mamíferos. Isso abriu novas possibilidades legais pra estudar como as células funcionam e pra criar novas bioterapias. Vários pares de aaRS/tRNA foram modificados pra permitir a incorporação de diferentes ncAAs nas proteínas em eucariontes. Alguns desses pares vêm de E. coli, arqueias, e até misturas customizadas conhecidas como pares quiméricos.

Embora muitos ncAAs tenham sido introduzidos em células eucarióticas, a maior parte do sucesso vem de um par em particular (os pares de pirrolisina). A razão disso é que a sintase de pirrolisina é bem flexível e pode ser ajustada usando métodos simples disponíveis em E. coli. Mas os cientistas precisam de mais pares engenheirados pra aumentar a variedade de ncAAs que conseguem usar.

#O Atraente Par de EcLeuRS da E. coli

Um jogador promissor no jogo é o par de leucil-tRNA sintase (EcLeuRS)/tRNA da E. coli. Em mais de 20 anos, o EcLeuRS foi moldado pra adicionar um conjunto pequeno, mas diverso, de ncAAs. Embora tenha avançado um pouco, ainda tá atrás do seu par de pirrolisina em relação ao número de ncAAs utilizáveis. Um percalço no processo é que os métodos usados pra modificar o EcLeuRS em leveduras não tem sido os melhores.

Pra melhorar o jogo, os pesquisadores desenvolveram dois sistemas baseados em leveduras pra selecionar mutantes úteis do EcLeuRS. O primeiro é uma seleção baseada na sobrevivência que usa uma versão quebrada de um ativador transcricional, e o segundo usa um método de separação fluorescente chamado FACS. O sistema baseado em sobrevivência tem sido mais popular, já que permite testar grupos maiores de mutantes em menos tempo.

#Melhorando o Sistema de Seleção

Mas o sistema de seleção baseado em sobrevivência existente pro EcLeuRS pode ter problemas. Por exemplo, às vezes ele permite que os mutantes errados sobrevivam por causa de um gremlin chamado “expressão vazada.” Depois de algumas experimentações, os pesquisadores descobriram que conseguiam aumentar a rigidez da seleção adicionando outro códon de parada no gene do fator de transcrição. Isso significa que só aqueles mutantes que realmente fazem o trabalho seriam selecionados.

Fazendo esses ajustes, os pesquisadores conseguiram encontrar novos mutantes EcLeuRS que aceitavam vários ncAAs, levando a um aumento empolgante no seu arsenal de ncAAs. Eles focaram em três ncAAs importantes como o ácido 2-aminocaprílico, ONBC (um derivado de citrulina fotocaguardada) e Kacme (uma nova modificação para modificações pós-traducionais da lisina).

#Evolução Direcionada para Melhor EcLeuRS

Com o novo sistema de seleção em ação, os cientistas estavam ansiosos pra modificar ainda mais o EcLeuRS. Eles criaram uma biblioteca de mutantes mudando partes específicas da estrutura do EcLeuRS. Isso significava que conseguiam encontrar mutantes que conseguiam reconhecer e incorporar os novos ncAAs. Depois de algumas rodadas de seleção, conseguiram identificar vários mutantes de sucesso.

Eles também enfrentaram um problema de “trapaça,” onde alguns clones não codificavam as mutações necessárias mas ainda assim sobreviviam à seleção. Pra resolver isso, em vez de reutilizar as mesmas células de levedura pra cada rodada de seleção, eles isolaram o DNA promissor e introduziram em células novas. Isso levou a resultados muito melhores e ajudou a eliminar os trapaceiros.

#A Busca pela Incorporação Eficaz de ncAA

Depois de confirmar a funcionalidade do novo sistema de seleção, os pesquisadores decidiram focar em fazer mutantes do EcLeuRS que pudessem incorporar eficientemente o ONBC. Esse ncAA é importante pra adicionar uma modificação específica (citrulina) que pode impactar como as proteínas se desempenham. Ao correr seu processo de seleção, encontraram vários clones que conseguiam usar o ONBC com sucesso e produzir as proteínas desejadas.

Em mais um experimento, eles tentaram introduzir o Kacme nas proteínas-essa modificação está ligada à regulação da expressão gênica. Os cientistas precisaram criar um mutante especial do EcLeuRS pra cumprir essa tarefa, o que fizeram através do seu sistema de seleção otimizado. Eles testaram a eficiência dessas novas variantes, e muitas mostraram resultados excelentes em células de mamíferos.

#Poliespecificidade: Uma Surpresa Espectacular

Curiosamente, descobriram que alguns dos novos mutantes do EcLeuRS eram “super-poliespecíficos,” permitindo que incorporassem uma ampla gama de ncAAs. Isso foi bem inesperado, já que parecia que conseguiam carregar vários aminoácidos incomuns sem modificações adicionais. Eles desbloquearam o potencial de incluir diferentes funcionalidades nas proteínas sem ter que começar do zero.

Pra te dar uma ideia, alguns desses mutantes permitem a incorporação de rótulos ou modificações especiais que podem ajudar os cientistas a rastrear proteínas ou entender melhor como elas funcionam. É como ter um canivete suíço pra modificações de aminoácidos-muitas ferramentas pra trabalhos variados!

#A Importância da Ornithina

A ornitina, um aminoácido não canônico, tem aplicações naturais em proteínas e pode ser particularmente útil no estudo de peptídeos bioativos. Porém, incorporá-la diretamente pode ser complicado devido à instabilidade na ligação típica entre aminoácido-tRNA. Pra resolver isso, os pesquisadores criaram uma versão fotocaguardada chamada ONBO, que pode ser incorporada facilmente e ativada com luz.

Eles ficaram empolgados quando um dos novos mutantes do EcLeuRS, B11, conseguiu incorporar ONBO facilmente nas proteínas. Quando exposto à luz, ele liberava ornitina, abrindo uma nova avenida para estudos bioquímicos.

#Conclusão

O avanço de tecnologias que permitem a adição de aminoácidos não canônicos às proteínas abriu caminho pra novas descobertas em biologia molecular. Ao otimizar os métodos de seleção e engenheirar mutantes eficientes do EcLeuRS, os pesquisadores expandiram significativamente seu arsenal. À medida que continuam explorando essa área, as possibilidades de como esses novos aminoácidos podem ser usados em pesquisa e medicina estão apenas começando a se desdobrar.

Considere isso como uma jornada culinária onde os chefs (cientistas) continuam melhorando suas receitas (métodos) pra criar pratos (proteínas) mais diversos e empolgantes que podem mudar como tratamos doenças ou entendemos processos celulares no futuro. Então, da próxima vez que você pensar em proteínas, lembre-se, tem um mundo inteiro de ingredientes não convencionais esperando pra ser explorado!