Novas descobertas sobre a modificação m6Am no mRNA

Nucleotídeos modificados têm um papel crucial na função do mRNA, a molécula que carrega informações genéticas para a produção de proteínas nas células. Um dos nucleotídeos modificados mais comuns no mRNA é chamado de m6Am (N6,2’-O-dimetiladenosina). Essa modificação especial está no começo do mRNA, conhecido como nucleotídeo de início de transcrição (TSN). O TSN corresponde a uma posição no DNA onde a transcrição começa.

Quando um gene é transcrito em mRNA, o TSN geralmente recebe uma modificação chamada modificação 2’-O-metil. Essa alteração é feita por uma enzima chamada CMTR1. Se o TSN for uma adenosina, uma modificação adicional pode acontecer quando outra enzima chamada PCIF1 adiciona um grupo metil, resultando em m6Am.

Pesquisas mostram que m6Am é importante para o funcionamento das células. Por exemplo, células normais não parecem crescer mais devagar quando não têm PCIF1. Mas, sob estresse oxidativo, a falta de PCIF1 pode atrapalhar o crescimento celular. Em células cancerígenas, especialmente durante alguns tratamentos, a ausência de PCIF1 pode aumentar as taxas de morte celular. Além disso, quando ocorrem infecções virais, a falta de PCIF1 pode aumentar a replicação do HIV e afetar outros vírus.

Dada a importância do m6Am, os cientistas têm tentado identificar e estudar mRNAs que contêm essa modificação. Estudos iniciais indicaram que os mRNAs podem existir na forma m6Am ou em uma forma não modificada chamada Am (2’-O-metiladenosina), sendo Am a mais comum. Vários métodos foram desenvolvidos ao longo dos anos para identificar genes modificados por m6Am. No entanto, apesar de muitos estudos mapeando essas modificações em diversos transcritos, o impacto preciso do m6Am no mRNA ainda não está claro.

#O Desafio em Compreender o m6Am

Um dos principais desafios em entender o m6Am está relacionado à forma como os genes foram caracterizados. Estudos de mapeamento anteriores trataram m6Am como se funcionasse como outros nucleotídeos modificados localizados dentro do mRNA. No entanto, m6Am, por estar no começo do transcrito, é influenciado pelas diferentes maneiras que um gene pode ser expresso, levando a várias isoformas de transcritos que começam em pontos diferentes. Isso significa que muitos genes não têm um único nucleotídeo de início, tornando difícil atribuir um status de modificação específico com base em estudos anteriores.

Além disso, esses estudos categorizaram cada gene como tendo m6Am ou não. Essa classificação binária não leva em conta a possibilidade de que alguns transcritos possam ter níveis variados de m6Am, com alguns contendo m6Am e outros contendo Am. Essa falta de nuances pode levar a conclusões incorretas sobre o papel do m6Am.

Vale também mencionar que m6Am é comum em RNAs nucleares pequenos (snRNAs), que estão envolvidos no processo de splicing. Inicialmente, pensava-se que a maioria dos snRNAs começava com Am. No entanto, estudos posteriores revelaram que um número significativo desses snRNAs também contém m6Am, que é posteriormente desmetilado para Am por outra enzima chamada FTO.

#CROWN-seq: Um Novo Método para Mapear m6Am

Para entender melhor a distribuição e o impacto do m6Am, os pesquisadores desenvolveram um novo método conhecido como CROWN-seq. Essa técnica permite que os cientistas mapeiem com precisão os TSNs de todas as isoformas de transcrição 5’ e quantifiquem os níveis de m6Am presentes nesses locais.

O CROWN-seq é único porque enriquece os sinais dos TSNs ao analisar seletivamente as extremidades do mRNA. Durante o CROWN-seq, um tratamento químico converte Am em uma forma diferente, permitindo que os pesquisadores determinem se o TSN está modificado como m6Am ou permanece como Am. Isso é feito separando os transcritos com cap m7G e quantificando os níveis de m6Am presentes em cada local de início em vários tipos de células.

Os achados do CROWN-seq revelaram uma quantidade significativa de diversidade de TSNs entre os genes, demonstrando que muitos genes não podem ser caracterizados com precisão por um único nucleotídeo de início de transcrição. A pesquisa mostrou que quase todas as isoformas de transcritos iniciados por A têm alta estequiometria de m6Am, significando que m6Am é a forma predominante no início das transcrições nesses casos.

#Descobertas sobre a Distribuição e Níveis de m6Am

O método CROWN-seq identificou um total de 219.195 TSNs, dos quais 92.278 foram identificados como A-TSNs em várias linhas celulares humanas. Esse mapeamento extenso indica a alta prevalência de m6Am no mRNA, contrastando com suposições anteriores baseadas em métodos menos precisos.

Os dados sugerem que m6Am está associado a níveis mais altos de expressão gênica, com transcritos que iniciam com m6Am aparecendo com mais frequência do que se reconhecia anteriormente. Os efeitos de níveis variados de m6Am foram notavelmente diferentes entre os vários mecanismos de transcrição. Especificamente, certos motivos nas regiões promotoras dos genes estavam correlacionados com níveis de m6Am, sugerindo que a presença de m6Am pode aumentar a transcrição.

#A Relação Entre m6Am e Transcrição

Uma das revelações intrigantes da pesquisa é a conexão direta entre m6Am e atividade transcricional. A maior estequiometria de m6Am em transcritos estava geralmente ligada a níveis aumentados de expressão gênica. Essa relação levanta questões sobre se m6Am atua como um fator estabilizador nos mRNAs ou se tem um papel distinto no processo de iniciação da transcrição.

O estudo descobriu que A-TSNs com níveis mais altos de m6Am experimentaram uma queda significativa na expressão quando a enzima PCIF1 foi desativada. Em contraste, A-TSNs com níveis mais baixos de m6Am mostraram mudanças mínimas na expressão. Isso sugere uma possível dependência do m6Am para mecanismos de transcrição que envolvem motivos específicos do promotor.

#Observações em Vários Tipos Celulares

Os pesquisadores também investigaram a estequiometria de m6Am em nove linhas celulares diferentes, observando altos níveis em geral. Embora a expressão de PCIF1 tenha correlacionado com os níveis de m6Am até certo ponto, mesmo linhas celulares com baixa expressão de PCIF1 ainda mostraram alta estequiometria de m6Am. Essa observação indica que fatores além de PCIF1 podem contribuir para a regulação do m6Am no mRNA.

Além dos mRNAs, o CROWN-seq também quantificou os níveis de m6Am em snRNA e snoRNA. Curiosamente, os achados mostraram que os snRNAs tinham um perfil diferente de modificações de m6Am, com níveis geralmente mais baixos e mais variabilidade entre diferentes linhas celulares em comparação com o mRNA.

#O Papel do FTO na Regulação do m6Am

Os achados destacam o papel do FTO, uma enzima que desmetila m6Am, no controle dos níveis de m6Am em snRNAs e snoRNAs. A pesquisa indicou que a expressão de FTO tinha uma correlação negativa com os níveis de m6Am, ou seja, níveis mais altos de FTO levaram a níveis mais baixos de m6Am. Quando o FTO foi desativado, os níveis de m6Am em snRNAs aumentaram significativamente, demonstrando que o FTO é um regulador importante.

Embora o FTO desempenhe um papel crítico nos snRNAs, seu efeito sobre o m6Am no mRNA foi mínimo, sugerindo que o m6Am pode ser regulado por mecanismos diferentes nesses dois tipos de RNA.

#Conclusão: Uma Nova Perspectiva Sobre o m6Am no mRNA

A introdução do CROWN-seq proporcionou uma visão mais clara do m6Am no mRNA. Estudos anteriores se basearam muito na ideia de que os genes poderiam ser representados por um único TSN, levando a possíveis imprecisões no mapeamento do m6Am. O CROWN-seq aborda essas questões mapeando todos os locais de início e medindo os níveis de m6Am quantitativamente.

A pesquisa destaca a importância do m6Am na iniciação da transcrição, em vez de na estabilidade. A correlação do m6Am com o aumento da abundância do transcrito sugere que ele pode desempenhar funções regulatórias específicas associadas a mecanismos de transcrição guiados pela sequência do promotor central.

Avançando, mais estudos são necessários para explorar completamente as funções do m6Am e suas interações com várias vias celulares, incluindo como isso pode influenciar a função de snRNA e snoRNA. A relação entre m6Am e a iniciação da transcrição pode ter implicações profundas para nossa compreensão da regulação e expressão gênica em todas as células.