dNTPレベルの調整：細胞周期制御におけるFssCの役割

すべての生き物は、細胞周期って呼ばれる一連のステップを通じて成長したり繁殖したりする。このサイクルは、細胞がちゃんと生きて機能するために特定の順番で起こらなきゃいけない。もしこのステップがうまくコントロールされなかったら、DNAの損傷や細胞死みたいな深刻な問題が起こることもある。サイクルの重要な部分には、DNAを作るために欠かせないデオキシヌクレオシド三リン酸（DNTP）って呼ばれる構成要素のグループがある。これらのdNTPのレベルは、細胞周期の間ずっと注意深く管理されなきゃいけない。レベルが高すぎたり低すぎたりすると、DNAのコピー中のミスや新しいDNAを作るプロセスが遅れるなどの問題が起こる。

#dNTPレベルの調整

DNAのコピーが始まると、dNTPのレベルが増加する。この増加は重要で、DNAを作る酵素に必要な材料を提供するから。ここで重要な酵素の一つがリボヌクレオチドレダクターゼ（RNR）で、DNAコピー中にRNRはもう一つの分子、リボヌクレオシド三リン酸（rNTP）からさらにdNTPを作るのを手伝う。RNRの活性は細胞周期の異なるポイントで変化する。細胞がS期（DNAがコピーされる部分）に入ると、RNRはdNTPをもっと作るために活性化される。このフェーズの外では、dNTPのレベルを低く保つために抑えられる。

もう一つの酵素のセット、デオキシグアノシン三リン酸加水分解酵素（Dgts）も、dNTPのレベルを管理するのを手伝っていて、dNTPをよりシンプルな分子に分解する。Dgtsはすべての生物に存在するけど、その正確な役割はまだ完全には理解されていない。

#Dgtsについて私たちが知っていること

あまり多くのDgtsは深く研究されていなくて、彼らの違いが何をしているかについての曖昧なアイデアを生んでいる。DgtsはHD加水分解酵素スーパーファミリーって呼ばれる、さまざまな分子を分解するのに重要な酵素の大きなカテゴリーに属している。すべてのDgtsはdNTPを分解するために似た方法を使うけど、異なる基質を好むことがある。一部のDgtsは、効果的に働くためにdNTPを異なる場所で結合させる特殊な条件が必要。これらの条件は、彼らの活性部位にどの金属イオンが存在するかによって変わる。

哺乳類では、SAMHD1と呼ばれるDgtがS期の外でdNTPレベルを下げる。一部の研究者は、SAMHD1のようなDgtsが利用可能なdNTPを減らすことで、ウイルスが細胞内でコピーされるのを防ぐのに役立つかもしれないと提案している。このアイデアは、ウイルスが他の細菌におけるDgtをブロックする方法を持っているのを科学者たちが発見したときに生まれた。研究によって、特定の細菌DgtsがdNTPを削減し、ウイルスDNA複製を停止させることでウイルス感染から防御するのに役立っていることが示されている。

#dNTPレベルが細胞周期調整に与える影響

dNTPの高レベルは、細胞がS期に入るのを遅らせることがある。たとえば、人間の細胞にSAMHD1が存在しないと、dNTPプールが増えて、より多くの細胞がG1期（DNAコピーが始まる前の期）にとどまることになる。同様に、トリパノソーマ・ブルセイという原虫のDgtを取り除くと、より多くの細胞がG1期に留まることになる。酵母では、RNRを過剰に活性化すると、DNAコピー中にdNTPが増えるはずなのに、G1期が延長される。このことから、dNTPレベルが高すぎるとG1からSへの移行を妨げる複雑なシステムが存在することが示唆される。

私たちは、Dgtsが非複製細胞でdNTPレベルを低く保つのを助け、S期へのスムーズな移行を可能にすると提案する。

#C. crescentus Dgtの研究

私たちは、特異な細胞周期で知られるカウロバクター・クレセントゥスという細菌からDgtを特定した。この細菌には、運動能力のあるスワーマー細胞と、定常的なストーク細胞という2つの主要な細胞タイプがある。スワーマー細胞はDNAのコピーを始めることができず、まずストーク細胞に変わる必要がある。C. crescentusは不均等に分裂し、それぞれの細胞タイプの1つを生成する。ストーク細胞はS期にすぐに再入ることができるが、スワーマー細胞はG1に留まる。

fssCという遺伝子が、スワーマーからストーク細胞への変化を手助けしている。テストしたところ、fssCが欠けた変異株は、野生型よりもジェル状の媒体を速く移動した。私たちはまた、細胞内の重要なタンパク質を可視化するために特別な色付きタグを使って、細胞タイプを区別した。結果は、fssC変異体がスワーマー細胞の割合が高いことを示し、スワーマー期が長いことを意味している。

#遺伝子スクリーニングとfssCの特定

私たちは、スワーマー細胞が表面を感知することに関連する遺伝子を発見するための遺伝子スクリーニングでfssC遺伝子を見つけた。スワーマー細胞は、鞭毛を使って周囲を感じ取り、表面に付着するのを助ける経路を活性化する。私たちはfssCを潜在的な表面感知遺伝子として特定した。

この研究は、FssCがdNTPを減少させる仕組みと、細胞がその周期を進む方法にどのように影響を与えるかを理解することに焦点を当てている。fssCを削除すると、細胞内のdNTPレベルが上昇し、細胞周期のストーク（S）期への進入が遅れることが分かった。また、fssC変異体は複製の起点が分割され、複製されるのが遅れることが示され、dNTPレベルが高いとDNAコピーの開始を妨げることを示している。

#FssCの移動および移行における役割

C. crescentusの細胞は、鞭毛を使って柔らかい媒体を通って移動できる。fssCを削除すると、細胞は通常より約30%遠くまで移動した。スワーマー細胞はその期の間だけ活動するため、この移動の増加は、スワーマーからストーク型への移行の遅れを示している。

顕微鏡を使って、異なる細胞周期段階を示す特定のタンパク質を観察することができた。PleCとDivJというタンパク質を蛍光色でタグ付けすることで、異なる色のタグを持つスワーマー細胞とストーク細胞を区別できた。これにより、細胞周期の異なる段階を明確に識別することができた。

PleCが新たに分裂した細胞で焦点がより広がるのにかかる時間を追跡すると、fssC変異体が通常よりも長くかかることが分かり、fssCがストーク細胞への時間通りの変化に重要であることが確認された。

#FssCの活性の特性化

fssC遺伝子はDgtをコードしていると考えられている。私たちはFssCがdNTPを水和する方法を、実験室条件で検討した。FssCは、すべての4つの主要なdNTPに作用することが分かり、dGTPに対する最も強い好みを持っていることが確認された。反応中に利用可能な金属イオンの種類によって、その活性が変わることもわかった。

FssCが機能しないバージョンを作成するために、その構造の特定の部分を変えた。この非活性型のFssCは、私たちの実験室テストでdNTPを削減できなかった。さらに、この非活性な形をfssC変異細胞に発現させると、彼らはdNTPレベルの制御を同じように持続し、切断活性が細胞周期管理において重要であることを強調している。

#fssCを削除したことによる細胞内dNTP濃度への影響

ターゲットテストを行うことで、fssCがdNTPレベルを低く保つ役割を検討した。正常な細胞とfssC変異体の文化からヌクレオチドを抽出したところ、変異体のdNTPレベルが正常な細胞と比べてかなり高いことが分かった。これはFssCが低dNTPレベルを維持する役割を果たしていることを確認した。

#dNTPとDNA複製

また、fssC変異体の高いdNTPレベルがDNAコピーの速さに影響を与える可能性があると予想した。これを調べるために、正常細胞と変異細胞でのDNA複製の速度を測定するためのシーケンシング技術を使った。驚いたことに、DNAのコピー速度は両方の株で同じだった。これは、fssC変異体の高いdNTPレベルが実際のDNAコピー過程を遅らせなかったことを意味している。

#染色体分配とDNA複製の遅延

次に、fssC変異体が染色体の複製起点を分離する速さに遅延があるかどうかを見た。複製の起点に接続するMipZというタンパク質に蛍光タグを融合させて、この焦点が細胞分裂後に複製されるタイミングを監視した。fssC変異体は、通常株よりも時間がかかり、遅延を示した。

同期した細胞の複製起点のコピー数を確認するためにqPCRという別の方法を使用したところ、fssC変異体が正常よりも低いレベルであることが再び示された。これは、fssCの削除がDNA複製開始の遅延を引き起こすことを強調している。

#結論

この研究を通じて、Dgt fssCがC. crescentusの細胞周期のS期への進入を調整するために重要であることが明らかになった。dNTPレベルが高いとDNAコピー開始の遅延が起こり、FssCの活性がdNTPレベルを低下させ、細胞がS期にスムーズに移行できるようにしている。

この研究は、Dgtsが細菌だけでなくさまざまな生命形態にどれだけ重要な役割を果たしているかを強調している。dNTPレベルを調整するメカニズムは多くの生物に共通しているかもしれないと私たちは考えていて、それを理解することが、細胞周期調整に関する洞察につながるかもしれない。今後の研究が、dNTPレベルがDNA合成の開始にどのように影響し、他の要因が細胞周期調整に寄与するかを明らかにするために必要である。