タンパク質精製における汚染物質の対処

タンパク質精製は、科学実験の重要なステップだよ。特定のタンパク質を溶液の他の物質から分離するために使われるんだ。このプロセスは、タンパク質の研究、薬の開発、生化学的プロセスの探求に欠かせない。でも、精製中に不明なソースからの不要なタンパク質が一緒に分離されちゃうと、研究が難しくなることもあるんだ。

この記事では、タンパク質から作った新しいタイプのナノ粒子の精製中に直面した問題について話すよ。ターゲットのナノ粒子と一緒に分離された不明なタンパク質が見つかったんだ。この汚染タンパク質は、私たちが扱っていたいくつかのサンプルにも存在していて、何なのか特定することが重要だった。先進的なイメージング技術とコンピューターツールを使って、汚染物質を特定し、精製方法を改善したよ。

#背景

タンパク質精製は、さまざまな研究分野、特に生化学や分子生物学で使われている一般的な技術だ。目的は、特定のタンパク質やタンパク質のグループを混合物から分離して、詳細に研究できるようにすることなんだ。初期分離、サイズや電荷に基づく分離、さらなる精製など、いくつかのステップが含まれることがある。

私たちのケースでは、設計された二成分ナノ粒子に取り組んでいた。このタイプのナノ粒子は、特定の方法で組み立てられるように工学された二つの異なるタンパク質を組み合わせて作られる。私たちが目指していたナノ粒子には、目的の機能に必要な特定の構造があったんだ。

#課題

精製活動中、ターゲットのナノ粒子と一緒に小さいタンパク質が出現するのに気づいた。この汚染タンパク質は、現在のサンプルだけでなく、私たちの研究室の他のさまざまなサンプルにも存在していた。不要なタンパク質の存在は、設計したナノ粒子の量と純度を測定するのを難しくした。

最初は、この汚染物質が設計プロセスの成果なのか、他のサンプルからの汚染の結果なのか、あるいは使用していたバイ菌から自然に発生したタンパク質なのか分からなかった。この問題に対処するために、汚染タンパク質を特定し、精製プロセスを洗練させる必要があると考えたんだ。

#特定に使った技術

未知のタンパク質を特定するために、二つの先進的な技術、クライオ電子顕微鏡法（Cryo-EM）とモデルアンジェロという機械学習ツールを使ったんだ。

クライオ-EMは、研究者が非常に高い解像度でタンパク質を観察できる強力なイメージング技術だ。タンパク質サンプルを急速に凍結し、何千枚もの画像を撮影するんだ。これらの画像を分析することで、タンパク質の構造の明確なイメージを得ることができる。

モデルアンジェロは、利用可能な構造データに基づいてタンパク質の原子モデルを構築するために深層学習を使用するソフトウェアツールだ。クライオ-EM画像から生成された密度マップを分析し、タンパク質構造を表すモデルを構築できるんだ。

この二つの技術を組み合わせることで、汚染タンパク質の構造についての洞察を得ることができた。クライオ-EMデータを処理し、モデルアンジェロを使って、私たちの設計したナノ粒子と汚染タンパク質を表すモデルを構築するのを助けたよ。

#汚染物質の観察

分析を始めると、汚染タンパク質が八面体の形を持つ小さな粒子として現れ、私たちの設計したナノ粒子に似ていることが分かった。これは驚きだった。なぜなら、私たちのデザインはより複雑な構造を目指していたからだ。

詳細な分析を行い、顕微鏡で観察した粒子のサイズと形状を比較した。設計したナノ粒子は、汚染タンパク質よりもはるかに大きな質量とサイズを持つと予測されていた。この違いにより、サンプル中でそれらを区別することができた。

私たちの努力にもかかわらず、汚染タンパク質は精製中に分離されたものの大部分を占めていて、収率と純度に大きく影響したため、 downstream の分析や特性評価が信頼できなくなってしまった。

#汚染物質の特定

未知の汚染タンパク質を正しく特定するために、クライオ-EMから収集したデータを使っていくつかの実験を行った。密度マップを生成した後、モデルアンジェロを使って観察された密度に一致する配列フラグメントを生成したんだ。

モデルアンジェロからの出力では、汚染タンパク質のいくつかの可能な配列が明らかになった。それから、Protein BLASTというツールを使って、これらの配列を知られているタンパク質のデータベースと比較して、一致を見つけた。興味深いことに、多くの上位ヒットがジヒドロリポアミドスクシニルトランスフェラーゼ（DLST）というタンパク質に対応していることが分かった。このタンパク質は、遺伝子工学に使用されるバイ菌から得られるサンプルで一般的な汚染物質であることが知られているんだ。

#精製プロトコルの見直し

DLSTが汚染物質として特定されたので、サンプルからそれを除去するために改訂された精製プロトコルを開発する必要があった。以前の研究では、DLSTが多くのタンパク質と共に精製されることが示されていたが、共分離の理由は明確ではなかった。私たちは、DLSTの表面特性が精製プロセスに使用される樹脂との相互作用に寄与している可能性を探求し始めた。

一つの仮説は、DLSTの表面にヒスチジン残基が含まれていて、これが樹脂のニッケルイオンに結合し、ヒスチジンタグを持つターゲットタンパク質と共に共精製される可能性があるというものだった。このアイデアをテストするために、精製方法を改良して、脱離バッファーのイミダゾール濃度を変更し、DLSTをより効果的に放出できることを期待したんだ。

これらの変更にもかかわらず、サンプル中にDLSTが検出された。次に、バッファーのナトリウム塩濃度を上げて、DLSTとターゲットタンパク質の間の非特異的相互作用を弱めようとした。塩濃度を上げることでDLSTのレベルを減少させるのには成功したが、設計したナノ粒子の収率も大幅に減少してしまった。

#汚染物質の成功した除去

より良い解決策を見つけるために、精製中にタンパク質の特性を向上させることができる補助剤を取り入れることにした。私たちは、グリシンやアルギニンなどのアミノ酸をバッファーに追加した。これらの化合物は、タンパク質間の不要な相互作用を減少させ、全体的な安定性を向上させることが知られているんだ。

これらの補助剤を精製バッファーに追加したことで、素晴らしい結果が得られた。DLSTをほぼ完全にサンプルから除去できただけでなく、設計したナノ粒子の収率も大幅に増加したんだ。これはプロジェクトにとって大きな突破口で、高純度のサンプルを得ることができた。

#クライオ-EMの解像度の重要性

DLSTを特定し、精製プロトコルを最適化した成功は、特にクライオ-EMのような技術を使った実験データの質の重要性を強調しているよ。データの解像度は、タンパク質の構造を正確に特定できる能力に影響を与えるんだ。私たちは、解像度2.51 Åを達成し、汚染タンパク質を自信を持って特定するのに十分な詳細を収集できた。

私たちのアプローチの適用性について興味があったので、異なる解像度での特定ワークフローの効果をテストした。クライオ-EMデータをさまざまな解像度で処理して、DLSTを正確に特定できるかを確認したところ、低解像度でも私たちの方法は効果的であることが分かった。これは、高品質なデータが得られない状況でも役立つ可能性があることを示しているんだ。

#結論

要するに、ナノ粒子サンプルから汚染タンパク質DLSTを特定して除去することは、私たちの精製プロセスを改善し、実験の質を確保するための重要なステップだったよ。先進的なイメージング技術や計算ツールを活用することで、困難な状況を洗練と最適化の機会に変えることができたんだ。

私たちの経験は、タンパク質精製技術の徹底的な理解の重要性や、発生しうる潜在的な課題を強調している。クライオ-EMや機械学習ツールなどの新技術の統合は、研究者がタンパク質精製の複雑さに対処するための強力な手段を提供し、さまざまなアプリケーションでタンパク質を研究し利用する能力を向上させるんだ。

私たちの改良された精製プロトコルの成功した適用は、私たちの作った二成分ナノ粒子のさらなる研究の扉を開いた。開発した方法は、タンパク質精製や特性評価において同様の課題に直面している他の研究者にとってのモデルにもなりうるよ。