過剰なDNA複製が細菌細胞の死を引き起こす

細胞は新しい健康な細胞を作るために、自分のDNAを慎重に複製して分ける必要がある。このプロセスは通常、起源と呼ばれるDNAの特定のポイントから始まる。この複製がいつ起こるかのタイミングは重要で、間違いがあると、新しい細胞に正しい量のDNAがないなどの問題が起こることがある。いくつかの細菌では、このプロセスにDnaAという特別なタンパク質が関与していて、DNAの複製を始める手助けをしている。

細菌では、DNAの複製は通常一つの主要な起源から始まる。DnaAタンパク質はDNAの特定の部分に付着して、それをほどいて複製の準備をする。しかし、DNAの複製のスタートがうまくいかないと、十分なDNAが作られなかったり、逆に多すぎたりして、どちらも細菌の成長を妨げることがある。

DNA複製がやりすぎになると、DNA鎖の切れなどの深刻な問題が起こる。この現象は一般的な細菌である大腸菌（Escherichia coli）に見られ、DNAの複製が多すぎると、DNAの修復に問題が生じて深刻な損傷を引き起こす。もっと不思議なのは、DNAが切れても細胞が必ずしも死ぬわけではないということだ。

この研究では、DNAの複製がやりすぎになるとどうなるかを、2種類の細菌：バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）とスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）で調べた。どちらのケースでも、DNAの複製が多すぎると細胞が死ぬが、細胞が死ぬ方法は異なる。B. subtilisの細胞は伸びて破裂し、S. aureusの細胞はDNAの管理に違いが見られるが、同じ方法で死ぬわけではない。

#材料と方法

#成長条件

異なる種類の細菌は、特定のアガー上で育てられ、生育を助ける。例えば、B. subtilisとE. coliは栄養アガーで、S. aureusはトリプチック大豆アガーで育てられた。それぞれの細菌は成長に特定の温度を好み、大腸菌は37℃で最もよく育ち、他は30℃で最適だった。成長を助けるために栄養素や抗生物質が必要に応じて追加された。

#細菌株

研究に使用された細菌株の詳細は補足表に記載されている。

#B. subtilis株の準備

新しいB. subtilis株を作成するために、研究者たちは特定の成長媒体にB. subtilisの細胞を浸す方法を使用した。細胞はまず一晩媒体で育てられ、その後希釈されて新しいDNAを吸収できるように処理された。このDNAには、複製能力を変える遺伝子が含まれていた。

#S. aureus株の準備

S. aureusには、エレクトロポレーションと呼ばれる異なる方法が使用された。これは、細胞に短い電気ショックを与えて新しいDNAを細胞に導入するものだ。細胞はB. subtilisと同様の栄養豊富な媒体で準備され、処理された。

#プラスミドの構築と管理

プラスミドは異なる遺伝子を運ぶように修正できる小さなDNAの輪で、E. coliで熱ショック法を使用して作成された。さまざまなプラスミドが構築され、細菌のDNA複製の開始に影響を与える遺伝子が含まれた。

#細菌の成長テスト

異なる条件下で細菌がどれだけ生き残るかを測定するために、研究者たちはスポットテストを行った。小さな量の細菌をアガープレートに置いて、どれだけ成長するかを観察した。また、自動プレートリーダーを使って、液体媒体の成長を時間とともに測定した。

#顕微鏡観察

研究者たちは特別な顕微鏡を使用して細菌を観察し、成長するにつれて細胞に起こる変化を確認した。異なる染料が細胞の一部、例えばDNAや膜を際立たせるために使用され、DNA複製の影響を調べるのが容易になった。

#DNA分析

細胞内のDNAを調べるために、サンプルはDNAを保存するための化学物質で処理され、その後、複製がどれだけ進んでいるかを調べるために特定のテストを使用された。

#マウスマクロファージでのテスト

この研究にはマウスを使用したテストが含まれ、S. aureusが免疫細胞にさらされるとどうなるかを観察した。マクロファージという免疫細胞の一種が使われ、細菌が免疫系の攻撃にどれだけ耐えられるかを調べた。

#B. subtilisにおけるDNA複製の過剰開始

特別に設計されたシステムを使用して、研究者はB. subtilisでどれだけDNA複製が起こるかを制御できた。過剰にDNA複製を開始させるDnaAのバージョンを使い、DnaAを調整する別のタンパク質を制御することで、この過剰な複製をオンオフできた。

#過剰開始の影響

研究者たちがこの過剰な複製を許可すると、B. subtilisの細胞は伸びたり最終的に破裂したりするなどのストレスの兆候を示した。調整タンパク質なしで成長させると、次第に生存能力が低下し、数時間後には個体数が大きく減少した。

#DNA損傷応答の活性化

DNAが損傷を受けると、細菌は損傷を修復しようとする応答システムが作動する。このシステムはSOS応答として知られ、重大なDNA損傷があるときに活性化される。研究では、DNA複製の過剰開始がこの応答を引き起こすことも示され、膜の問題や最終的な細胞死などのさらなる問題につながった。

#応答の測定

SOS応答の活性化を確認するために、研究者たちはこの応答が活性化されると光る特殊なマーカーで細菌をタグ付けした。過剰開始を経験した細胞のほとんどは強い信号を示し、彼らが苦しんでいることを示していた。

#膜の問題と細胞溶解

DNA複製が増加すると、細菌の細胞膜の完全性が失われ始めた。研究者たちは、過剰開始が起こると多くの細菌の膜が損傷していることを観察した。これは、特別な染料を使用して確認され、損傷した細胞のみがその染料に反応し、損なわれた状態にあることを示した。

#より詳しく見る

顕微鏡を使用することで、科学者たちは過剰開始が細胞の伸びだけでなく、時間とともに膜の完全性やDNAの内容の喪失を引き起こすことを視覚的に確認できた。

#プロファージの活性化と細胞溶解

細菌内に存在する特定のウイルス粒子、つまりプロファージが活性化されると細胞死を引き起こす可能性がある。過剰開始による死がこれらのプロファージに起因するかを確認するために、研究者たちはこれらのウイルス要素が欠けているB. subtilisの株をテストした。結果として、プロファージがなくても、細胞は依然として過剰開始のために死んでしまうことがわかった。

#依存関係の確認

さらなる実験では、DNA複製の過剰開始がDnaAによって使用される複製の起源に直接関連していることが示された。研究者たちが重要なDnaA結合部位を除去することで複製の起源を変更すると、細胞はもはや過剰開始から死ななくなった。これにより、過剰なDNA複製の影響が複製の起源での特定の相互作用から生じたことが確認された。

#DNA修復システムの役割

過剰開始が細胞の生存にどのように影響するかを理解するために、研究者たちは修復システムが果たす役割を調査した。損傷したDNAを修復するための遺伝子が削除されると、B. subtilisの細胞は過剰開始条件でより良く生存できた。これは、複製と修復の間の対立が細胞に過剰なストレスと死を引き起こしていることを示している。

#S. aureusへの拡張

次に、この研究はS. aureusに焦点を当て、類似の過剰開始が細胞死につながるかどうかを調べた。研究者たちは、DnaAタンパク質の変異体を通じて過剰開始を誘発できるシステムを構築した。

#効果の観察

B. subtilisと同様に、S. aureusで過剰開始を誘発すると、顕著な細胞成長の問題が発生した。細菌は明らかに大きくなり、DNA内容物を失う兆候を示した。この研究は、B. subtilisとS. aureusの両方がDNA複製を過剰に開始することで成長が抑制されることを確認した。

#感染に対する意味合い

S. aureusが一般的な病原体であるため、研究者たちはこれらの発見が実際の感染にどのように適用できるかを探った。感染中に過剰開始を誘発することで、免疫系が細菌と戦うのをサポートできる可能性があると考えた。

#結論

この研究は、細菌が過剰なDNA複製によって自己破壊するメカニズムについての重要な洞察を提供する。DNA複製を開始するシステムを操ることで、研究者たちは有益な細菌と有害な細菌の両方で細胞死を引き起こす深刻なストレスを作り出すことができる。このアプローチは、病原細菌を標的にした治療法を開発する新たな道を開くことを示しており、抗生物質戦略の新しい道を代表している。

この発見は、DNA複製と細胞の健康との関係を利用した革新的な抗菌アプローチにつながる可能性があり、攻撃者が簡単には抵抗できない新しい治療法の道を開くかもしれない。