Progressi nella misurazione dell'orientamento delle molecole fluorescenti

Misurare come sono orientate le molecole fluorescenti può fornire informazioni importanti su strutture e attività in biologia e scienza dei materiali. Attaccando un marcatore fluorescente a un campione biologico che si muove con la struttura, gli scienziati possono scoprire il suo comportamento osservando l'orientamento del marcatore. Molti marcatori fluorescenti si illuminano in un modo specifico quando sono eccitati dalla luce, quindi i ricercatori possono usare microscopi speciali per vedere come cambia il modello luminoso. Questo può aiutarli a capire l'orientamento dei marcatori.

Ci sono diverse tecniche che fanno Misurazioni in piccole aree, limitate dalla dimensione della luce usata. Facendo molte misurazioni dello stesso punto con diverse impostazioni luminose, i ricercatori possono calcolare l'orientamento dei marcatori fluorescenti. Questo ha aiutato a studiare vari fenomeni biologici come membrane cellulari, dinamiche proteiche e materiali diversi.

Recentemente, nuovi metodi hanno permesso agli scienziati di misurare molecole singole. Queste tecniche possono ora fornire più informazioni, inclusa la posizione e l'orientamento delle molecole, che è prezioso per studiare cose come come il DNA cambia forma sotto stress o il comportamento di proteine specifiche. Tuttavia, questi metodi hanno limitazioni legate alla velocità delle misurazioni e ai tipi di marcatori utilizzabili.

Dopo aver esaminato le tecniche disponibili, è stata trovata una lacuna nella capacità di misurare sia l'orientamento che la posizione di gruppi di marcatori fluorescenti. È stato proposto un nuovo sistema chiamato sistema di illuminazione a foglio a doppia vista. Questo setup ha due braccia per eccitare e rilevare la luce, consentendo un'illuminazione più variegata e una migliore risoluzione quando si osservano campioni.

#Utilizzo di Polarizzatori a Cristalli Liquidi

Nei primi test, sono stati aggiunti polarizzatori a cristalli liquidi a entrambe le braccia di questo nuovo sistema di illuminazione a foglio per vedere come potesse essere misurato l'orientamento dei marcatori fluorescenti in piccole aree. Tuttavia, combinare i dati delle singole molecole con i metodi tradizionali usati per i gruppi di molecole si è rivelato difficile. È stato sviluppato un nuovo approccio ispirato a una tecnica di imaging esistente chiamata imaging per risonanza magnetica a tensore di diffusione per aiutare a misurare più efficacemente l'orientamento tridimensionale dei marcatori fluorescenti.

Questo nuovo metodo si è concentrato sull'utilizzo di una Funzione di Distribuzione dell'Orientamento, che è un modo per rappresentare e analizzare l'orientamento dei marcatori. Ha permesso agli scienziati di identificare problemi con le misurazioni e di trovare una soluzione, chiamata inclinazione del foglio di luce. Questo aggiustamento ha migliorato la capacità di risolvere le ambiguità di orientamento. I risultati successivi hanno mostrato varie strutture nelle cellule, comprese membrane e complessi proteici.

#Comprendere le Funzioni di Distribuzione dell'Orientamento (ODFs)

Le funzioni di distribuzione dell'orientamento (ODFs) servono come modelli per rappresentare come sono orientati i marcatori fluorescenti in un'area specifica. Per molti marcatori comuni, è ragionevole assumere che i loro modelli di assorbimento ed emissione possano essere semplificati a un'unica asse. Riassumendo tutti i marcatori all'interno di un'area piccola, i ricercatori possono visualizzare l'ODF come una funzione sferica, dove la dimensione della sfera rappresenta il numero di marcatori orientati in ogni direzione.

I marcatori fluorescenti possono ruotare mentre vengono misurati, portando a cambiamenti negli ODF. Il modo in cui questi marcatori vengono eccitati ed emettono luce significa che i loro modelli sono sempre simmetrici. Quindi, gli ODF possono essere usati efficacemente per modellare il comportamento di gruppi di marcatori all'interno di strutture biologiche.

Diverse forme di ODF possono rappresentare vari comportamenti dei marcatori fluorescenti. Per esempio, marcatori che possono ruotare liberamente mostreranno un ODF sferico, mentre quelli che sono vincolati a una superficie assumeranno forme diverse. Comprendere questi ODF è cruciale per interpretare come i marcatori fluorescenti si comportano in ambienti diversi.

#Eccitazione e Rilevazione a Doppia Vista

In questa sezione, viene spiegato il setup del sistema di illuminazione a foglio a doppia vista. Questo sistema è composto da due lenti a immersione in acqua che possono sia eccitare che rilevare luce. Utilizzando queste lenti, i ricercatori possono creare pattern di eccitazione diversi per studiare i campioni. La possibilità di passare tra diverse impostazioni di illuminazione consente un'eccitazione selettiva di marcatori specifici nel campione.

L'uso di decomposizioni armoniche sferiche consente ai ricercatori di simulare e analizzare gli ODF per comprendere meglio i loro design. Le simulazioni mostrano come gli ODF possano essere scomposti in componenti più semplici, il che aiuta a trarre conclusioni sui campioni studiati.

Il sistema di imaging consente misurazioni migliorate e può catturare molte informazioni sulle orientazioni 3D dei marcatori fluorescenti. I dati possono essere visualizzati in diversi modi, inclusa la visualizzazione di dove la maggior parte dei marcatori è orientata o la densità dei marcatori in diverse aree.

#Affrontare le Sfide di Misurazione con l'Inclinazione del Foglio di Luce

Durante il processo di imaging, sono state trovate componenti angolari mancanti nei dati, il che ha portato a difficoltà nel recuperare tutte le orientazioni. Aggiungendo capacità di inclinazione al sistema del foglio di luce, gli scienziati potevano illuminare la stessa area campionata mentre accedevano a nuove informazioni angolari.

Questa modifica aiuta a produrre un miglior contrasto e illuminare più orientamenti, consentendo una comprensione più completa di come i marcatori siano orientati in tre dimensioni. I ricercatori hanno scoperto che utilizzare una combinazione di misurazioni diverse con i fogli di luce inclinati ha migliorato la loro capacità di risolvere le forme degli ODF e misurare accuratamente le orientazioni.

Il nuovo setup è stato convalidato esaminando vescicole giganti unilamellari (GUVs) e ha mostrato che i marcatori fluorescenti si allineavano come previsto. La capacità di correggere i problemi di misurazione precedenti ha dimostrato i benefici dell'approccio inclinato, portando a risultati più accurati.

#Validazione con Campioni Biologici

Dopo aver stabilito che l'inclinazione del foglio di luce migliorava il recupero dell'orientamento, il metodo è stato usato per studiare vari campioni biologici. Il sistema è stato testato usando GUVs, xilema vegetale e proteine actiniche nelle cellule.

Nei test delle GUV, sono stati analizzati gli ODF e le orientazioni di picco, mostrando che i marcatori puntavano costantemente lontano dalla superficie come previsto. I setup si sono dimostrati capaci di rilevare sottili cambiamenti nell'orientamento.

Esaminando le cellule di xilema, gli ODF riflettevano le orientazioni attese delle strutture di cellulosa, confermando la conoscenza precedente da studi concentrati su osservazioni bidimensionali. Le misurazioni hanno dimostrato l'accuratezza del sistema e la sua capacità di rivelare nuove intuizioni sulle strutture tridimensionali.

Infine, le proteine actiniche nelle cellule U2OS sono state analizzate per mappare le loro orientazioni. I risultati hanno confermato l'allineamento atteso dei filamenti di actina lungo i loro assi lunghi, mostrando l'efficacia del sistema nel visualizzare strutture complesse in tre dimensioni.

#Indagare il Comportamento Cellulare su Nanofili

Il sistema è stato ulteriormente utilizzato per studiare fibroblasti murini coltivati su array di nanofili. Questo setup aiuta a indagare come le cellule interagiscono con il loro ambiente circostante.

Le immagini mostrano che i filamenti di actina si allineano con i nanofili più vicini, permettendo agli scienziati di esplorare il comportamento cellulare locale. I modelli ricostruiti indicavano distinte popolazioni di orientamenti di actina e sono stati utilizzati per derivare metriche che illustrano come questi filamenti interagiscono con il loro ambiente locale.

I ricercatori hanno confrontato i risultati di diverse disposizioni di nanofili e hanno trovato che le orientazioni di actina variavano significativamente a seconda del substrato. I dati hanno rivelato una correlazione tra il comportamento locale dei filamenti di actina e la forma complessiva delle cellule, fornendo intuizioni su come l'architettura cellulare si relaziona alla matrice extracellulare sottostante.

#Considerazioni Finali

I progressi nella misurazione delle orientazioni delle molecole fluorescenti hanno stabilito un ponte tra studi bidimensionali e intuizioni tridimensionali. L'introduzione di tecniche come le funzioni di distribuzione dell'orientamento ha affinato il modo in cui gli scienziati analizzano i dati provenienti da marcatori fluorescenti. Il sistema di illuminazione a foglio a doppia vista, migliorato tramite l'inclinazione del foglio di luce, ha permesso misurazioni più precise, portando a nuove scoperte sulle strutture biologiche.

C'è ancora potenziale per miglioramenti in questi sistemi di imaging, particolarmente per aumentare la velocità di misurazione e migliorare l'uniformità delle risposte. Il lavoro futuro potrebbe introdurre nuovi marcatori fluorescenti ed esplorare misurazioni temporali per comprendere meglio il comportamento dinamico di sistemi biologici complessi.

In generale, il lavoro ha ampliato le capacità per studiare le orientazioni molecolari, permettendo ai ricercatori di ottenere una comprensione più profonda dei fenomeni biologici e dei materiali in tre dimensioni.