Rivalutare la fosforilazione e la funzione di PANX1

PANX1 è un tipo di grande canale che si trova nelle cellule. Gioca ruoli importanti in diverse funzioni del corpo, come la risposta immunitaria, l'infiammazione e il restringimento dei vasi sanguigni. Quando PANX1 viene attivato, permette il rilascio di ATP e altre sostanze dall'interno della cellula verso l'esterno. Queste sostanze agiscono poi come segnali per le cellule vicine, aiutandole a comunicare e rispondere di conseguenza.

#Background sulla Ricerca su PANX1

La ricerca su PANX1 va avanti da quasi vent'anni. Gli scienziati stanno cercando di capire la sua struttura e come funziona. Nel 2020, i ricercatori hanno usato una tecnica chiamata crio-microscopia elettronica per ottenere delle informazioni sulla struttura di PANX1. Questo li ha aiutati a capire come è costruito il canale, come gli ioni si muovono attraverso di esso e come può essere bloccato. Nonostante i progressi nella comprensione di PANX1, ci sono ancora molte cose che non sappiamo su come si apra e si chiuda in diverse situazioni.

C'è interesse nel capire quali segnali attivano PANX1 e come questa attivazione può essere invertita. Questa conoscenza potrebbe non solo aiutare gli scienziati a capire meglio la sua funzione, ma anche a sviluppare farmaci per malattie legate a PANX1.

#Regolazione di PANX1

La funzione di PANX1 può essere influenzata da varie modifiche dopo che viene prodotto. Questi cambiamenti includono il taglio della proteina, l'aggiunta di molecole di zucchero, l'aggiunta di gruppi fosfato e l'attaccamento di un gruppo ossido nitrico. Un esempio significativo è quando una specifica proteasi taglia PANX1 in un modo che gioca un ruolo critico nella rimozione delle cellule morte dal corpo.

La ricerca ha anche mostrato che l'aggiunta di gruppi fosfato, un processo noto come Fosforilazione, potrebbe aiutare a controllare l'attività di PANX1. Un tipo di proteina, la Src chinasi, sembra essere importante per questo processo. Quando alcuni recettori sulla superficie delle cellule vengono attivati, Src viene attivata, il che potrebbe portare infine all'apertura di PANX1.

#Fosforilazione e PANX1

Diversi studi hanno esaminato come la fosforilazione influisce sull'attività di PANX1. In particolare, gli scienziati si sono concentrati su siti specifici della proteina PANX1 che possono essere fosforilati. Ad esempio, esperimenti hanno evidenziato due siti principali, Tyr198 e Tyr308, come punti di interesse. La Src chinasi sembra avere un ruolo nella fosforilazione di questi siti, che, in teoria, dovrebbe influenzare l'apertura di PANX1.

Tuttavia, ci sono ancora molte domande. Non è chiaro se PANX1 venga fosforilato direttamente da Src o se altre Proteine siano coinvolte in questo processo di segnalazione. In alcuni studi recenti, i ricercatori hanno rilevato attività in un altro sito, Tyr150, che potrebbe anch'esso essere influenzato da diverse chinasi.

#Obiettivi dello Studio

L'obiettivo delle ricerche recenti era esplorare come la fosforilazione altera l'attività del canale di PANX1. Inizialmente, gli scienziati hanno tentato di vedere se potevano rilevare la fosforilazione di PANX1 in siti specifici utilizzando anticorpi commerciali. Tuttavia, hanno scoperto che questi anticorpi non riconoscevano PANX1 fosforilato nei loro esperimenti.

Questo solleva preoccupazioni sulla validità degli anticorpi utilizzati e sulle conclusioni tratte sulla fosforilazione di PANX1. Suggerisce che la visione consolidata su come PANX1 venga attivato dalla fosforilazione potrebbe dover essere rivalutata.

#Indagine sui Siti di Fosforilazione

Per capire meglio la fosforilazione di PANX1, i ricercatori hanno analizzato la sua struttura. Si sono concentrati su due residui di tirosina particolari (Tyr199 e Tyr309) che si trovano vicino a un'apertura del canale. Questi luoghi sono significativi perché potrebbero influenzare il funzionamento di PANX1.

I ricercatori hanno esaminato PANX1 di diverse specie per vedere se questi residui sono conservati nelle varie forme della proteina. Questo potrebbe aiutare a chiarire quali anticorpi potrebbero essere efficaci nel rilevare la fosforilazione e se funzionerebbero in diversi modelli animali.

#Esperimenti con Anticorpi

I ricercatori si sono poi rivolti a anticorpi commerciali che si diceva mirassero specificamente a PANX1 fosforilato. Hanno testato questi anticorpi in linee cellulari che esprimevano PANX1 umano o di topo.

Quando hanno esaminato campioni da cellule che esprimevano solo PANX1, gli anticorpi non mostrano alcun segnale, anche se i ricercatori hanno confermato che PANX1 era presente. Questo indicava che gli anticorpi non riconoscevano la proteina non fosforilata. Quando hanno guardato a campioni con la Src chinasi presente, gli anticorpi non riuscivano ancora a rilevare PANX1 fosforilato, suggerendo che probabilmente stavano reagendo con altre proteine.

Questo ha portato i ricercatori a sospettare che gli anticorpi, usati in studi precedenti, potrebbero non rilevare specificamente PANX1 fosforilato, il che mette in discussione i risultati precedenti.

#Ulteriore Analisi In vitro

Per rafforzare la loro analisi, i ricercatori hanno quindi effettuato esperimenti in vitro utilizzando PANX1 purificato e proteine Src. Hanno anche utilizzato un anticorpo anti-fosfotirosina più ampio per vedere se potevano rilevare qualche fosforilazione. Tuttavia, è emerso che gli anticorpi riconoscevano solo Src e non PANX1. Questo suggerisce che in queste condizioni, PANX1 non viene fosforilato, almeno da Src.

Questo ha portato alla conclusione che ogni volta che PANX1 è co-espresso con Src attivato, potrebbe comunque non essere un bersaglio per la fosforilazione. Anche se altri studi suggerivano che alcuni siti di fosforilazione erano attivati in diversi tipi cellulari, questi risultati indicano che nei loro allestimenti sperimentali, non è stata osservata tale attività.

#Esplorazione di Diversi Tipi Cellulari

Per controllare se il tipo di cellula utilizzato influenzava i risultati, i ricercatori hanno testato PANX1 in una linea cellulare diversa chiamata Neuro2A. Qui, hanno osservato che PANX1 era pesantemente modificato da molecole di zucchero. Dopo aver trattato queste cellule per rimuovere quei gruppi di zucchero, hanno scoperto che Src non influiva sullo stato di fosforilazione complessivo di PANX1.

In entrambe le cellule HEK293T e Neuro2A, i dati suggerivano che PANX1 non veniva fosforilato da Src. Era cruciale escludere che il tipo di cellula influenzasse l'attività di fosforilazione.

#Test su PANX1 di Topo

Come ultima verifica, i ricercatori hanno esaminato PANX1 di topo per vedere se potesse comportarsi diversamente rispetto a PANX1 umano. Utilizzando le stesse condizioni sperimentali di prima, hanno confermato che PANX1 di topo mostrava anch'esso nessuna evidenza di essere fosforilato da Src in presenza di vari mutanti di Src.

#Impatto sull'Attività del Canale PANX1

Con la consapevolezza che PANX1 potrebbe non essere fosforilato da Src, i ricercatori volevano vedere come questo influenzasse la funzione del canale stesso. Hanno condotto esperimenti elettrofisiologici per misurare l'attività di PANX1 in cellule con Src attivo.

I risultati non hanno mostrato differenze significative nelle correnti che scorrevano attraverso i Canali di PANX1 quando Src era presente. Questo suggerisce che Src non influisce sull'attività del canale PANX1, supportando ulteriormente l'idea che la fosforilazione dipendente da Src potrebbe non essere un meccanismo regolatore principale per PANX1.

#Conclusione

Le prove raccolte da più tecniche e tipi cellulari suggeriscono che PANX1 non è significativamente fosforilato da Src negli scenari esaminati dai ricercatori. Invece, sembra che possano esistere altri meccanismi regolatori che influenzano l'attività di PANX1.

Data l'importanza di identificare accuratamente i siti di fosforilazione e comprendere come influiscano sulla funzione delle proteine, i risultati richiedono una rivalutazione attenta delle affermazioni precedenti che collegano Src alla fosforilazione di PANX1.

I ricercatori sono incoraggiati a ripensare le attuali visioni su PANX1 ed esplorare percorsi alternativi e proteine che potrebbero interagire con PANX1 per influenzare la sua funzione. Anche la comunità scientifica è invitata a utilizzare metodi più sensibili e specifici per investigare gli eventi di fosforilazione, per ridurre i malintesi sul ruolo della fosforilazione nella regolazione di proteine come PANX1.

Questo studio apre la strada a ulteriori indagini sul comportamento di PANX1 in diversi contesti e potrebbe portare a nuove strade per la ricerca terapeutica legata a malattie associate a questo canale.