Progressi nelle tecniche di criotomografia elettronica

La criotomografia elettronica (Cryo-ET) è una tecnica che serve a creare un'immagine 3D dettagliata di campioni biologici. Il processo prevede di scattare una serie di immagini mentre si ruota il campione in un microscopio elettronico. Queste immagini vengono poi unite per formare quello che si chiama un tomogramma. Però ci sono alcune sfide. Quando i campioni vengono esposti alla radiazione, possono danneggiarsi, creando rumore nelle immagini. Inoltre, i campioni sono spesso sottili, quindi non tutte le viste possono essere catturate, portando a errori nell'immagine finale.

Per affrontare questi problemi, i ricercatori possono concentrarsi su specifiche strutture all'interno di queste immagini rumorose. Trovando e allineando queste strutture, molte immagini dello stesso particella possono essere mediate insieme. Questo aiuta a migliorare la qualità complessiva dell'immagine 3D, rendendola più chiara. Questo metodo di mediazione delle sezioni più piccole dei Tomogrammi è conosciuto come mediazione di subtomogramma. È stato utile nello studio di parti importanti delle cellule ad altissime risoluzioni.

#Strumenti e Software per Cryo-ET

Ci sono vari strumenti disponibili per lavorare con i dati cryo-ET. Un software popolare per catturare immagini è SerialEM. Salva informazioni importanti sul processo di acquisizione delle immagini in file speciali. Un altro strumento chiamato Tomo5, prodotto da Thermo Fisher, usa anche un formato simile per memorizzare i dati.

Per ricostruire un'immagine 3D in modo accurato, è necessario determinare come il campione è posizionato e orientato nel microscopio. IMOD è un pacchetto software ben noto che aiuta in questo processo. Recentemente, un altro strumento chiamato AreTomo ha guadagnato popolarità per rendere più facile e automatizzato questo processo di allineamento, soprattutto per certi tipi di campioni.

Dopo il processo di allineamento, i ricercatori possono passare a creare i tomogrammi. Ci sono metodi diversi per farlo, a seconda dell'uso previsto dei tomogrammi, come interpretazione visiva o mediazione di subtomogrammi. Ogni metodo ha i suoi vantaggi e requisiti specifici per preservare i dettagli.

#La Necessità di una Pipeline Standardizzata

Nonostante ci siano molti strumenti disponibili, non c'è un approccio coerente tra i vari programmi software. Questa mancanza di standardizzazione può confondere i nuovi utenti e rende difficile sfruttare al meglio le funzionalità di ogni programma. Per semplificare il processo, è stata sviluppata una nuova pipeline di elaborazione delle immagini in RELION-5, un software open-source.

Questa pipeline permette agli utenti di partire da immagini grezze e dai dati correlati e finire con immagini 3D di alta qualità e modelli automatici. La pipeline include passaggi per stimare parametri importanti, allineare le immagini e ridurre il rumore nei tomogrammi. Inoltre, sono inclusi strumenti grafiche per aiutare gli utenti a selezionare e annotare le immagini in modo interattivo.

#Importazione dei Dati nella Pipeline

Il primo passo per utilizzare la pipeline RELION-5 è importare i dati delle immagini grezze insieme ai metadati associati. Il sistema crea file che riassumono le informazioni sulla serie di immagini in inclinazione. Questo include dettagli generali come tensione, dimensione del pixel e altri valori critici che influenzano la qualità dell'immagine.

Gli utenti devono anche determinare come cambia la défocus lungo l'asse di inclinazione nelle immagini. Questo può richiedere un po' di tentativi, ma le impostazioni predefinite funzionano spesso bene per la maggior parte dei microscopi comunemente utilizzati.

#Correzione degli Errori di Movimento

Una volta importate le immagini, il passo successivo è correggere eventuali problemi di movimento nelle immagini causati dal processo di acquisizione. Questo viene fatto utilizzando algoritmi avanzati, assicurando che le immagini siano allineate correttamente. Il sistema può anche creare immagini sommate per ulteriori elaborazioni o analisi.

#Stima della Funzione di Trasferimento di Contrasto

La funzione di trasferimento di contrasto (CTF) è cruciale per comprendere come il sistema di imaging cattura i dettagli del campione. Dopo aver corretto gli errori di movimento, un lavoro speciale nella pipeline stima il CTF per ogni immagine. Questo lavoro elabora le immagini in parallelo, accelerando la correzione e aiutando a migliorare la qualità dell'immagine.

#Selezione delle Immagini per l'Analisi

Dopo aver stimato il CTF, gli utenti possono rivedere le immagini in un visualizzatore che consente loro di escludere qualsiasi immagine non adatta per l'analisi. Questo può includere immagini sfocate o ostacolate. Le immagini selezionate saranno poi utilizzate per i passaggi successivi nella pipeline.

#Allineamento delle Immagini

Il compito successivo è allineare la serie di immagini inclinate, che è cruciale per costruire un modello 3D accurato. La pipeline offre wrapper che si collegano ad altri strumenti software, rendendo più semplice il processo di allineamento.

I risultati dell'allineamento vengono poi memorizzati in un nuovo set di file, che saranno utilizzati nei passaggi successivi.

#Ricostruzione dei Tomogrammi

Ora che le immagini sono correttamente allineate, la pipeline può ricostruire i tomogrammi. Questo lavoro prende le immagini allineate e le usa per creare i modelli 3D. Possono essere impiegati vari metodi per questo, a seconda della qualità e del dettaglio richiesti nell'output finale.

Dopo aver ricostruito i tomogrammi, gli utenti riceveranno file che contengono link ai nuovi tomogrammi, che possono essere utilizzati per ulteriori analisi.

#Riduzione del Rumore nei Tomogrammi

Una volta che i tomogrammi sono stati ricostruiti, il passo successivo è ridurre il rumore utilizzando un programma di denoising specializzato. Questo passaggio migliora la chiarezza delle immagini, rendendo più facile identificare le strutture al loro interno.

#Selezione delle Particelle

Con i tomogrammi denoised pronti, gli utenti possono ora selezionare particelle individuali di interesse dalle immagini ricostruite. La pipeline include strumenti interattivi che permettono un'annotazione precisa di queste particelle, facilitando la raccolta di dati per ulteriori analisi.

#Estrazione di Subtomogrammi e 2D Particle Stacks

Dopo aver selezionato le particelle, il lavoro successivo nella pipeline è estrarre queste particelle individuali insieme alle loro informazioni rilevanti. Questo processo crea due tipi di output: pseudo-subtomogrammi e 2D particle stacks. La scelta tra queste opzioni dipende dai requisiti dell'analisi.

Le immagini delle particelle sono memorizzate in strutture di directory per una migliore organizzazione. Inoltre, la pipeline salva nuovi file che contengono informazioni sulle particelle di output.

#Mediazione delle Particelle

Una volta che i subtomogrammi o gli stack 2D sono pronti, i passaggi successivi includono vari metodi per mediare queste particelle per migliorare la qualità del modello 3D finale. La pipeline ha già metodi consolidati per eseguire questo tipo di mediazione, rendendo efficiente e semplice ottenere risultati.

#Raffinamento e Lucidatura

Per ulteriori miglioramenti, la pipeline include anche opzioni per affinare ulteriormente i modelli e lucidare i risultati. Questo passaggio si concentra sul miglioramento dell'allineamento complessivo e sulla correzione di eventuali problemi potenziali nei dati.

#Visualizzazione dei Risultati

I risultati di ogni passaggio possono essere visualizzati, dando ai ricercatori la possibilità di vedere come i modelli progrediscono durante il processo. Questo elemento visivo è cruciale per valutare la qualità del lavoro e fare eventuali aggiustamenti necessari.

#Conclusione

La pipeline RELION-5 semplifica il processo di lavoro con i dati cryo-ET, guidando gli utenti dall'importazione iniziale di filmati non elaborati fino alla creazione di modelli 3D ad alta risoluzione. La struttura dei metadati ben definita migliora la compatibilità tra diversi programmi, promuovendo flussi di lavoro migliori in quest'area di ricerca.

Con l'evoluzione continua del cryo-ET, lo sviluppo di tali pipeline assicura che i ricercatori possano facilmente accedere agli strumenti di cui hanno bisogno per avanzare il loro lavoro e ottenere approfondimenti più profondi sulle strutture di sistemi biologici complessi.