Avanzare l'attivazione dei recettori cellulari con la tecnologia del DNA

Le cellule comunicano con l'ambiente e si adattano alle funzioni in base ai segnali esterni. Questa comunicazione inizia spesso quando un recettore sulla superficie della cellula interagisce con una molecola specifica, chiamata ligando. Un gruppo chiave di recettori, noto come Superfamiglia dei Recettori del Fattore di Necrosi Tumorale (TNFRSF), gioca ruoli importanti in molti processi cellulari, inclusi crescita, morte e risposte immunitarie.

Per attivare il TNFRSF, è fondamentale che i recettori si raggruppino sulla superficie della cellula. Questo raggruppamento aiuta a iniziare il segnale necessario per le risposte cellulari. Un esempio è l'interazione tra il ligando induttore di apoptosi correlato al TNF (TRAIL) e un recettore chiamato Recettore di Morte 5 (DR5).

Anche se gli scienziati capiscono molto di questi recettori, i trattamenti attuali non attivano completamente certi tipi di TNFR, come 4-1BB, CD40 e DR5. I ricercatori hanno scoperto che presentare i ligandi in una forma attaccata alle membrane cellulari può migliorare la loro attivazione. Tuttavia, molti anticorpi usati per stimolare questi recettori richiedono che siano legati insieme, complicando il processo.

#Sfide nell'Attivazione dei Recettori

La distanza tra i ligandi è importante perché influisce su quanto bene attivano i recettori. Sono stati sviluppati alcuni metodi per raggruppare i ligandi usando tecniche che coinvolgono streptavidina o materiali diversi, ma questi approcci non forniscono un controllo preciso su quanto siano vicini i ligandi tra loro. Raggiungere una distanza inferiore a 10 nanometri è piuttosto difficile con questi metodi.

Le nanostrutture di DNA origami rappresentano una soluzione interessante. Queste strutture permettono ai ricercatori di disporre i ligandi con alta precisione, definendo esattamente quanti sono presenti e quanto distanti sono. Inoltre, a differenza di molti altri materiali, le nanostrutture di DNA rimangono stabili quando mescolate con siero umano.

#Costruire Nanostrutture di DNA

Molti studi hanno utilizzato nanostrutture di DNA per attivare i recettori cellulari. Per esempio, i ricercatori hanno usato schemi di DNA specifici per coinvolgere i recettori delle cellule T e attivare altre risposte immunitarie. Questo articolo si concentrerà sulla creazione di nanostrutture di DNA origami che raggruppano i recettori DR5 per potenziare l'uccisione cellulare.

Quando i recettori si raggruppano, subiscono un'attivazione. C'è una differenza tra raggruppamento normale e quello che si chiama super-raggruppamento. Il raggruppamento normale significa avvicinare i recettori, mentre il super-raggruppamento comporta la combinazione di cluster esistenti per amplificare l'effetto.

Al alcune proteine, come il TRAIL, formano naturalmente gruppi di tre (trimeri). Questi trimeri possono legarsi ai loro recettori corrispondenti sulla superficie della cellula, spingendo i recettori a raggrupparsi e attivare segnali all'interno della cellula.

I ricercatori hanno ingegnerizzato proteine per migliorare questo processo di raggruppamento. Un esempio è una versione modificata di TRAIL chiamata SC-TRAIL, creata collegando tre proteine TRAIL con piccole connessioni di peptide. Combinando SC-TRAIL con la tecnologia DNA, l'obiettivo è ottenere recettori DR5 super-raggruppati e studiare quanto bene possano uccidere le cellule.

#Strumenti e Materiali Utilizzati

Per creare le nanostrutture di DNA, sono necessari diversi materiali. Questi includono:

• Il genoma M13mp18 come impalcatura di DNA.
• Filtri e concentratori per purificare il DNA.
• Griglie per microscopia elettronica per visualizzare le strutture.
• Plasmidi e ceppi batterici specifici per esprimere le proteine SC-TRAIL.
• Vari tamponi e reagenti per la purificazione delle proteine.

#Progettazione delle Strutture di DNA

Creare una nanostruttura di DNA implica progettare la sua forma e struttura. Il processo di design inizia determinando la geometria della nanostruttura desiderata. Per il progetto in questione, è stata scelta una struttura a piramide esagonale.

Una volta fissato il design geometrico, devono essere identificate posizioni specifiche per legare le proteine. Esaminando la struttura del DNA e allineandola con i modelli proteici, i ricercatori possono designare dove si attaccheranno le proteine. Questo aiuta a garantire che le proteine siano spaziati correttamente per attivare i recettori in modo efficace.

#Modificare il DNA per l'Attacco delle Proteine

Alcune parti della struttura del DNA devono essere modificate per consentire l'attacco delle proteine. Estendendo specifici filamenti di DNA, i ricercatori possono creare spazi per legare le proteine. Questo passaggio è cruciale, poiché il posizionamento corretto migliorerà le possibilità di attivazione riuscita dei recettori quando la struttura finale sarà utilizzata negli esperimenti.

Quando la struttura del DNA è completa, è essenziale visualizzare le forme piegate usando tecniche come la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Questo consente ai ricercatori di confermare che le strutture siano correttamente formate e pronte per l'uso.

#Ingegneria delle Proteine

Dopo che le strutture di DNA sono state create, il passo successivo prevede di attaccare le proteine SC-TRAIL. Questo viene fatto attraverso un metodo astuto utilizzando un enzima chiamato sortasi, che aiuta a legare le proteine al DNA. Le proteine SC-TRAIL sono progettate appositamente per includere questo tag sortasi, consentendo loro di attaccarsi facilmente alle nanostrutture di DNA.

Per produrre SC-TRAIL, un gene specifico è introdotto in batteri, che poi crescono e producono la proteina. Dopo, la proteina deve essere purificata per rimuovere eventuali impurità. Questo processo implica l'uso di vari tamponi per isolare efficacemente la proteina desiderata.

#Attaccare le Proteine al DNA

Una volta purificate le proteine SC-TRAIL, subiscono una reazione per attaccare un piccolo tag chimico che aiuterà a legarle alla struttura di DNA. Questo viene realizzato tramite un metodo di chimica click in cui la proteina reagisce con il manico di DNA. In questo modo, i ricercatori assicurano che le proteine siano collegate alla struttura di DNA in modo stabile.

Dopo questo processo di collegamento, le strutture di DNA modificate con successo vengono purificate di nuovo per rimuovere eventuali proteine non legate o reagenti in eccesso.

#Testare l'Efficacia dell'Uccisione Cellulare

L'ultimo passo prevede di testare se le strutture di DNA con le proteine SC-TRAIL collegate possono effettivamente uccidere le cellule target. Le cellule Jurkat, un tipo di cellula immunitaria, vengono utilizzate per questi esperimenti. Le cellule vengono esposte a varie concentrazioni delle strutture di DNA.

Dopo l'incubazione, si conta il numero di cellule vive per determinare se le strutture di DNA hanno ucciso con successo le cellule target. I risultati mostrano che le strutture con SC-TRAIL sono molto più efficaci nel ridurre il numero di cellule rispetto a quelle senza le proteine.

#Riepilogo

Il lavoro descritto mostra come combinare la tecnologia del DNA con l'ingegneria delle proteine possa aumentare l'efficacia del segnale cellulare. Controllando come sono disposti i ligandi su un'impalcatura di DNA, i ricercatori possono ottimizzare l'attivazione dei recettori cellulari coinvolti in processi critici come la morte cellulare e la risposta immunitaria. Questo metodo apre nuove porte per sviluppare terapie che sfruttano questi meccanismi cellulari per trattare le malattie.