Frammentazione del DNA per un sequenziamento migliore

Quando si lavora con il DNA genomico per il Sequenziamento, spesso è utile spezzare il DNA in pezzi più piccoli. Questo processo si chiama Frammentazione. Spezzando il DNA in frammenti più piccoli, si possono ottenere risultati migliori con certe macchine per il sequenziamento, come quelle di Oxford Nanopore Technologies (ONT). Pezzi più piccoli rendono più facile misurare la concentrazione di DNA e possono aumentare la quantità totale di DNA che può essere sequenziata. Tuttavia, sebbene la frammentazione abbia i suoi vantaggi, può anche ridurre la lunghezza media dei frammenti di DNA.

#Perché frammentare il DNA?

Spezzare il DNA in pezzi più corti può aiutare in diversi modi. Prima di tutto, può rendere il campione più uniforme, il che significa che le dimensioni dei frammenti sono distribuite più equamente. Questa uniformità consente una migliore stima di quanta DNA c'è nel campione. Inoltre, frammenti più corti sono meno suscettibili di essere persi durante il processo di preparazione. I frammenti più lunghi possono essere più difficili da gestire e potrebbero perdersi durante vari passaggi di pulizia. Inoltre, sequenziare frammenti più corti porta spesso a un rendimento più elevato, il che significa più dati utilizzabili dal processo di sequenziamento.

Tuttavia, è importante riconoscere che la frammentazione ha anche degli svantaggi. Uno dei principali svantaggi è che riduce il N50 della libreria. Il N50 è una misura che indica la lunghezza dei frammenti di DNA, e avere lunghezze maggiori è generalmente desiderabile nel sequenziamento.

#Metodi di frammentazione

Ci sono alcuni modi per spezzare il DNA in pezzi più piccoli prima del sequenziamento, e uno dei metodi più rapidi è usare un dispositivo chiamato Covaris g-TUBEs. In questo metodo, il campione di DNA viene spinto attraverso una piccola apertura usando una centrifuga. La forza applicata può essere regolata, portando a diverse dimensioni dei frammenti di DNA. I principali fattori che influenzano come il DNA viene spezzato includono:

1. Volume del campione
2. Concentrazione di DNA
3. La forza applicata durante il processo di centrifugazione

Secondo le note del produttore, quando si frammenta il DNA in dimensioni inferiori a 8 kilobasi (kb), il tempo richiesto può essere ridotto. Tuttavia, per i nostri scopi, abbiamo deciso di mantenere il tempo a un minuto per ottenere i frammenti più lunghi che volevamo.

#Comprendere la preparazione del campione

Di solito, il DNA fornito per la preparazione varia da 1 a 2 microgrammi (µg). Durante la preparazione, abbiamo usato un volume più piccolo (50 µL) per evitare di dover regolare la concentrazione di DNA successivamente. Abbiamo notato che questo volume più piccolo ha avuto effetti notevoli sul processo di frammentazione. Ad esempio, usando 1500 RCF (forza centrifuga relativa) con 50 µL di un campione da 0,5 µg si è ottenuta una dimensione media dei frammenti di circa 14.051 paia di basi (bp), mentre un campione da 1 µg ha prodotto frammenti di media di 15.651 bp. Entrambe queste dimensioni sono più corte rispetto all'obiettivo di 20 kb che volevamo raggiungere.

Per trovare il modo migliore per raggiungere il nostro obiettivo, abbiamo testato diverse quantità di DNA e diverse forze centrifughe. I nostri obiettivi principali erano:

1. Identificare la RCF appropriata per ottenere frammenti di DNA attorno ai 20 kb da campioni che vanno da 0,5 a 4 µg.
2. Determinare il miglior metodo per misurare la dimensione dei frammenti.

Durante i nostri test, abbiamo scoperto che anche se i Covaris g-TUBEs sono elencati come monouso, potrebbero essere riutilizzati alcune volte prima che i membrane si intasassero.

#L'Esperimento

Abbiamo preparato tre tipi di campioni per ciascuna delle quantità di DNA: 0,5, 1, 2 e 4 µg. Ogni campione è stato testato a tre diverse forze centrifughe: 1000, 1500 e 2000 RCF. Abbiamo mantenuto il tempo di elaborazione a un minuto per tutti i campioni.

Per analizzare la dimensione dei frammenti di DNA, abbiamo utilizzato due dispositivi: il Femto Pulse System e il Fragment Analyzer. Il Femto Pulse è noto per la sua capacità di misurare frammenti più grandi, mentre il Fragment Analyzer fornisce anche dati preziosi ma potrebbe avere limitazioni con l'accuratezza delle dimensioni.

#Risultati

Siamo riusciti a preparare campioni usando i g-Tubes, e la frammentazione era chiaramente visibile nei risultati. Prima della frammentazione, il DNA mostrava un picco ampio nelle misurazioni, indicando frammenti lunghi. Dopo aver utilizzato i g-Tubes, abbiamo osservato un unico picco stretto, suggerendo che il DNA fosse stato effettivamente spezzato in pezzi più piccoli.

I risultati hanno mostrato che man mano che aumentavamo la quantità di DNA, la dimensione media dei frammenti aumentava a forze centrifughe più basse. Ad esempio, a 1000 e 1500 RCF, le dimensioni medie dei frammenti erano visibilmente più grandi con più DNA utilizzato. Tuttavia, a 2000 RCF, le differenze nelle dimensioni dei frammenti diventavano meno significative, indipendentemente dalla concentrazione di DNA.

Abbiamo anche osservato che aumentando la forza centrifuga tendeva a ridurre la dimensione media dei frammenti. Questo effetto era più evidente quando la quantità di DNA era maggiore.

#Confronto tra i sistemi di misurazione

Abbiamo confrontato i risultati del Femto Pulse e del Fragment Analyzer. Entrambi i sistemi generalmente fornivano risultati di dimensione media simili, ma c'erano alcune differenze. Il Femto Pulse tendeva a mostrare dimensioni di frammenti più piccole rispetto al Fragment Analyzer. Tuttavia, i frammenti più grandi apparivano più grandi quando misurati con il Fragment Analyzer.

In casi in cui la misurazione accurata è cruciale, raccomandiamo di eseguire più campioni o ripetere i test per garantire l'accuratezza, specialmente quando si utilizza il Fragment Analyzer, che a volte mostrava artefatti che rendevano le misurazioni difficili. Per ottenere i migliori risultati, è meglio eseguire impostazioni di corsa estese sul sistema Femto Pulse.

#Conclusioni

Basandoci sulle nostre scoperte, sembra che i Covaris g-TUBEs possano frammentare efficacemente il DNA e la dimensione dei frammenti può essere controllata regolando la forza centrifuga e la quantità di DNA utilizzata. Per ottenere frammenti di DNA attorno ai 20 kb, abbiamo scoperto che usare 1000 RCF era efficace per campioni di 1 µg o meno, mentre 1500 RCF era adatto per campioni da 2 µg. Per campioni da 4 µg, era necessaria una forza tra 1500 e 2000 RCF per ottenere frammenti nella gamma desiderata.

In generale, il nostro studio mostra che la frammentazione del DNA può essere un processo semplice che aiuta a preparare campioni per il sequenziamento, e nelle giuste condizioni, può produrre risultati utili e affidabili.