Progressi nei Sistemi di Comunicazione delle Cellule di Lievito

Il passaggio da organismi unicellulari a organismi multicellulari è un momento importante nella storia degli esseri viventi. Ha portato a una maggiore complessità nel modo in cui le cellule lavorano insieme. Questo cambiamento è avvenuto principalmente perché le cellule hanno iniziato a comunicare tra loro, aderire e assumere ruoli diversi. Il lievito, in particolare Saccharomyces cerevisiae, è un organismo comune usato in scienza e industria, ma di solito vive come cellula singola. Nonostante ciò, gli scienziati hanno creato strumenti per modificare il lievito in modi che permettono alle cellule di cambiare le loro funzioni in base a segnali esterni. Tuttavia, il lievito manca ancora degli strumenti per promuovere la comunicazione tra cellule e per farle aderire tra loro.

Negli organismi multicellulari, la comunicazione tra cellule è fondamentale per svolgere molte funzioni. Ci sono quattro modi principali in cui queste cellule si parlano: segnali autocrini, paracrini, endocrini e juxtacrini. I primi tre implicano l'invio di segnali attraverso l'aria o lo spazio, mentre il segnale juxtacrine si basa sul contatto diretto tra cellule. Un esempio di questo è il sistema synNotch, che aiuta le cellule dei mammiferi ad aderire e formare strutture più complesse.

Mentre gli scienziati hanno utilizzato efficacemente metodi di comunicazione basati sul contatto nelle cellule animali, non li hanno applicati al lievito, il che è essenziale per molti processi di ricerca e sviluppo di farmaci. Studi precedenti hanno esplorato come il lievito possa interagire con le cellule dei mammiferi e studiare le risposte immunitarie, ma un sistema di segnalazione diretto tra le cellule di lievito è ancora assente. Lo sviluppo di un tale sistema potrebbe far progredire significativamente la biologia sintetica.

#Segnalazione GPCR nel lievito

Un metodo di comunicazione cruciale in molte cellule è la segnalazione GPCR (recettori accoppiati a proteine G). I GPCR aiutano le cellule a rilevare e reagire all'ambiente circostante. Nel lievito, questi recettori regolano il comportamento di accoppiamento rilevando segnali specifici, come il fattore α. Questo peptide è secreto dal lievito e riconosciuto dai GPCR su altre cellule di lievito. Una volta rilevato, innesca una reazione a catena all’interno della cellula, portando a cambiamenti nell'espressione genica.

Gli scienziati hanno usato con successo GPCR provenienti sia da fonti animali che da lievito per facilitare la comunicazione e i comportamenti nel lievito attraverso segnali secreti. Tuttavia, c'è la possibilità di creare un sistema di comunicazione juxtacrine facendo dipendere la disponibilità di questi peptidi di segnalazione dal contatto diretto tra le cellule di lievito. Combinare questa idea con un modo per far aderire il lievito tra loro potrebbe aprire la strada alla creazione di strutture multicellulari.

#Progettazione del toolkit MARS

Per impostare un sistema di comunicazione basato sul contatto cellulare, i ricercatori hanno progettato un toolkit chiamato MARS (Sistema di Risposta Ancorata da Peptidi di Accoppiamento). Questo sistema utilizza tecniche di visualizzazione della superficie per attaccare diversi peptidi di segnalazione alla superficie delle cellule di lievito. Questi peptidi possono quindi interagire con i GPCR su cellule di lievito vicine.

Il sistema MARS è stato creato utilizzando ceppi di lievito specializzati progettati per visualizzare il peptide di accoppiamento α-fattore sulle loro superfici. Sono state ingegnerizzate due tipologie di cellule di lievito: cellule di visualizzazione, che mostrano il peptide, e cellule sensore, che hanno GPCR per ricevere i segnali. Quando il GPCR di una cellula sensore si lega al peptide visualizzato, innesca una serie di reazioni che portano a cambiamenti nell'espressione genica.

I test iniziali del sistema MARS hanno mostrato che poteva attivare con successo le cellule sensore quando le cellule di visualizzazione erano in stretto contatto. Questo è stato confermato attraverso esperimenti che confrontavano condizioni statiche e di agitazione. I risultati hanno suggerito che quando le cellule non sono in contatto, la segnalazione non funziona efficacemente.

#Ottimizzazione di MARS per una migliore funzionalità

Dopo i test iniziali, i ricercatori dovevano migliorare il sistema MARS per facilitare meglio la segnalazione. Hanno sperimentato modi diversi di visualizzare il peptide di segnalazione e come il peptide era legato alla superficie della cellula di lievito. Modificando il legame tra il peptide e la proteina di visualizzazione, miravano a migliorare l'interazione di legame con i GPCR.

Sono state provate diverse strategie, tra cui il cambiamento dell'orientamento del peptide visualizzato e la variazione della lunghezza del legame. Alla fine, la combinazione di aminoacidi all'inizio del peptide è stata identificata come un fattore chiave per migliorare la segnalazione cellulare.

Le ottimizzazioni hanno portato a una migliore attivazione delle cellule sensore in contatto diretto. Esperimenti aggiuntivi hanno confermato che il sistema di segnalazione funzionava meglio quando i due tipi di cellule erano in diretto contatto, rafforzando l'idea di utilizzare connessioni fisiche per una comunicazione efficace.

#Espansione del toolkit MARS

Per aumentare la varietà di metodi di comunicazione disponibili utilizzando MARS, i ricercatori hanno esplorato ulteriori sensori GPCR. Sostituendo il peptide visualizzato e il GPCR nel sistema esistente, hanno identificato nuove coppie che potevano anche funzionare efficacemente. Ottimizzare queste nuove coppie ha aiutato a stabilire una gamma più ampia di opzioni di segnalazione dipendenti dal contatto.

Tutte le coppie peptide-recettore testate hanno dimostrato chiare differenze nella risposta quando le cellule erano in contatto rispetto a quando non lo erano. Questi risultati hanno mostrato un livello significativo di ortogonalità tra le coppie, il che significa che potevano operare indipendentemente senza interferire tra loro.

#Creazione di circuiti logici multicellulari

Nell'ingegneria, gli organismi unicellulari affrontano sfide a causa di capacità limitate di incorporare nuovo DNA e gestire circuiti complessi. Sviluppare sistemi multicellulari consente la distribuzione dei compiti e potrebbe facilitare la creazione di comportamenti complessi. I ricercatori hanno mirato a progettare circuiti logici multicellulari utilizzando MARS per dimostrare queste possibilità.

Il team ha costruito circuiti scalabili che consentivano comunicazione tra diverse cellule. Ogni catena di cellule poteva trasmettere segnali attraverso sequenze definite, consentendo una cooperazione efficace. Gli esperimenti hanno anche mostrato la dipendenza del circuito dai contatti cellulari diretti affinché i segnali si propagassero, confermando l'importanza delle interazioni fisiche in questi sistemi.

Sono stati creati vari gate logici utilizzando MARS, tra cui gate OR, NOR, AND e XOR. Stabilendo condizioni specifiche per la segnalazione, i ricercatori hanno mostrato come questi circuiti logici potessero controllare i comportamenti in gruppi di cellule di lievito.

#Introduzione del toolkit SATURN

Una delle caratteristiche chiave necessarie per i sistemi multicellulari è l'adesione, che consente alle cellule di aderire tra loro. Sebbene il lievito possa naturalmente formare grumi, questi aggregati non sono selettivi. È stato sviluppato un toolkit chiamato SATURN (Toolkit di Adesione per Saccharomyces per il Patterning Multicellulare) per consentire l'adesione selettiva tra cellule di lievito ingegnerizzate.

SATURN è stato progettato per visualizzare coppie di proteine specifiche sulla superficie delle cellule di lievito, permettendo loro di aderire a proteine complementari su altre cellule. I ricercatori hanno generato varie coppie di proteine note per le loro forti proprietà di legame per facilitare questo. Il toolkit ha consentito con successo la formazione di aggregati definiti che potevano essere manipolati in base ai rapporti delle proteine visualizzate.

#Combinare MARS e SATURN per interazioni avanzate

Con l'istituzione dei toolkit MARS e SATURN, i ricercatori hanno cercato di combinarli per migliorare la segnalazione e l'adesione nelle cellule di lievito. Gli esperimenti hanno dimostrato che aggiungere interazioni adesive specifiche ha portato a un aumento dei livelli di output nelle risposte di segnalazione.

Sono stati testati tre schemi distinti che mostrano interazioni multicellulari. Il primo schema isolava diversi tipi di cellule senza adesione, impedendo interazioni. Il secondo schema consentiva un raggruppamento selettivo attraverso interazioni adesive specifiche, mentre il terzo schema creava connessioni tra diversi tipi di cellule, consentendo loro di attivarsi a vicenda.

Questi schemi illustrano il potenziale per creare interazioni complesse all'interno delle popolazioni di lievito combinando le capacità di segnalazione di MARS con l'adesione selettiva facilitata da SATURN.

#Sviluppo del sistema JUPITER

JUPITER (Sensore JUxtacrine per l'Interazione Proteina-Proteina) è stato introdotto come un nuovo sistema che utilizzava sia MARS che SATURN per monitorare le interazioni proteina-proteina nel lievito. Questo sistema collega la forza di legame tra due proteine ai cambiamenti nell'espressione genica all'interno delle cellule.

Con JUPITER, i ricercatori potevano visualizzare una proteina su cellule sensore mentre co-visualizzavano un'altra proteina e un ligando peptidico MARS su cellule di visualizzazione. Il design permetteva di monitorare direttamente le interazioni, fornendo un modo per valutare l'efficacia di varie interazioni proteiche.

Ottimizzando i componenti di JUPITER, i ricercatori hanno notevolmente aumentato la sua sensibilità e prestazioni, permettendogli di distinguere efficacemente tra interazioni proteiche strettamente correlate. Negli esperimenti, JUPITER si è dimostrato capace di differenziare tra vari nanocorpi con diverse affinità di legame.

#Screening per proteine migliorate utilizzando JUPITER

JUPITER è stato valutato per il suo potenziale come strumento di screening per identificare e selezionare proteine con capacità di legame migliorate. Un aspetto chiave di JUPITER è che può collegare interazioni positive a specifici output a valle, rendendolo adatto per esperimenti che richiedono output di espressione genica.

In un test, i ricercatori hanno ingegnerizzato una proteina di fusione che consentiva la crescita in mezzi nutritivi ridotti. Esaminando gli output delle cellule sensore, potevano determinare le capacità di legame di specifici nanocorpi durante co-colture. Gli esperimenti hanno dimostrato con successo che JUPITER poteva distinguere e selezionare efficacemente leganti ad alta affinità da una libreria di varianti.

#Conclusione

In sintesi, lo sviluppo dei toolkit MARS e SATURN rappresenta un passo significativo nella biologia sintetica, in particolare per manipolare le cellule di lievito. Con MARS che consente la comunicazione tra cellule e SATURN che permette la selettività nell'adesione, i ricercatori hanno aperto nuove porte per creare strutture e comportamenti multicellulari complessi.

Il sistema proof-of-concept JUPITER espande ulteriormente queste capacità consentendo il monitoraggio delle interazioni proteina-proteina collegando queste interazioni alle risposte di espressione genica. Gli strumenti e le strategie sviluppate attraverso questa ricerca possono portare a progressi in aree come lo sviluppo di farmaci, biosensori e biomanifattura, spingendo oltre i limiti di ciò che può essere realizzato con il lievito come organismo modello.