Nuove intuizioni su PIDD1 e proteine alternative

Negli esseri umani, i geni che producono proteine di solito si concentrano su una parte principale chiamata il frame di lettura aperto (ORF) o sequenza codificante (CDS). Questa è spesso l'ORF più lungo. L'RNA risultante da questi geni può mostrare lievi variazioni a causa dello splicing alternativo. Questo processo consente ai geni di creare diverse forme di proteine. Tuttavia, i ricercatori stanno scoprendo che alcuni geni possono effettivamente creare più di un tipo di ORF, portando alla produzione di più proteine.

Attualmente, non c'è un modo concordato per nominare questi ORF aggiuntivi e le loro proteine. Spesso vengono chiamati microproteine o proteine alternative. In questo studio, utilizzeremo i termini "ORF alternativi" (AltORFs) e "proteine alternative" (altProts) per distinguerli dai principali tipi di proteine, chiamati "ORF di riferimento" (refORFs) e "proteine di riferimento" (refProts).

#Importanza delle Proteine Alternative

Un primo studio ha esaminato due proteine dello stesso gene umano e ha scoperto che un tipo di proteina alternativa, chiamata altMID51, era presente in quantità molto maggiori rispetto alla proteina di riferimento. La scoperta di altMID51 come parte della macchina cellulare chiamata mitoribosoma è stata importante. Questo esempio mostra come esaminare queste proteine alternative possa offrire nuove intuizioni che potrebbero essere perse se ci concentriamo solo sulle proteine principali.

Per studiare come vengono prodotte le proteine, gli scienziati possono usare tecniche come il profiling ribosomiale (ribo-seq) per comprendere la produzione di proteine a livello di RNA, o la spettrometria di massa (MS) per studiarlo a livello di proteine. Tuttavia, identificare altORFs e altProts rimane una sfida perché spesso non sono nominati o riconosciuti nelle attuali banche dati. Questa mancanza di informazioni rende difficile scoprire le loro funzioni.

Per affrontare questa sfida, alcuni studi hanno combinato ribo-seq e proteomica. Questa fusione aiuta nell'annotazione di altORFs e altProts. Una risorsa chiamata OpenProt consente agli scienziati di trovare più di un ORF in un trascritto e annotare tutti gli ORF che sono più lunghi di 29 codoni attraverso diverse specie.

Rianalizzando grandi set di dati di ribo-seq e proteomica utilizzando OpenProt, i ricercatori possono raccogliere più prove sull'esistenza sia delle proteine alternative che di quelle di riferimento, insieme alla scoperta di geni che possono codificare più proteine.

#Il Gene PIDD1 e le Sue Proteine

Un gene specifico, la Proteina Indotta da P53 con un Dominio di Morte (PIDD1), codifica una proteina composta da 910 amminoacidi. Questa proteina viene tagliata in due parti durante il suo processamento: una parte N-terminale di 445 amminoacidi (PIDD-N) e una parte C-terminale di 465 amminoacidi (PIDD-C). La parte C-terminale viene ulteriormente suddivisa per produrre una proteina più piccola chiamata PIDD-CC.

PIDD1 svolge vari ruoli nel corpo, interagendo con diverse proteine per rispondere ai danni del DNA, monitorare i centrioli, attivare una via chiamata NFkB e innescare la morte cellulare. Cambiamenti o mutazioni nel gene PIDD1 sono stati collegati ad anomalie cerebrali e disabilità intellettive, anche se le ragioni esatte non sono ancora del tutto chiare.

In questo studio, è stato scoperto che PIDD1 è tra i potenziali geni multicoding dove sia la proteina di riferimento che una proteina alternativa chiamata altPIDD1 sono prodotte da ORF sovrapposti trovati nello stesso trascritto. AltPIDD1 è una nuova proteina che si localizza parzialmente all'interno delle strutture dello scheletro cellulare ed è tagliata durante il processo di apoptosi (morte cellulare programmata). Mentre molte nuove proteine appaiono nei primati, altPIDD1 è emersa per la prima volta nei mammiferi placentati.

Queste scoperte sfidano le idee tradizionali su come funzionano i geni nei mammiferi e mostrano la necessità di descrizioni migliori del potenziale codificante all'interno dei nostri genomi.

#Struttura del Gene PIDD1

Il gene PIDD1 è composto da 16 segmenti noti come esoni. La parte principale codificante di PIDD1 inizia con l'esone 2 e termina con l'esone 16. Curiosamente, c'è un secondo ORF che attraversa gli esoni 2 e 3, che si prevede crei altPIDD1. Secondo un database chiamato Ensembl, PIDD1 può produrre due tipi di RNA. È importante notare che entrambi i tipi provengono dallo stesso RNA, il che significa che PIDD1 e altPIDD1 vengono espressi insieme.

#Differenze tra altPIDD1 e PIDD1

Le sequenze di amminoacidi di altPIDD1 e PIDD1 sono diverse perché l'ORF di altPIDD1 utilizza un frame di lettura diverso rispetto a quello di PIDD1. Di conseguenza, anche se provengono dallo stesso gene, non sono considerati varianti l'uno dell'altro. AltPIDD1 contiene una grande quantità di prolina (un amminoacido) e include diversi residui di cisteina. Alcune parti della proteina sembrano essere disordinate, il che potrebbe indicare che può legarsi ad altre proteine. Le prime previsioni suggeriscono che la sua struttura assomigli a nastri, anche se queste previsioni hanno punteggi di fiducia più bassi.

I dati provenienti da più studi di proteomica indicano che altPIDD1 è presente in diverse linee cellulari umane e tessuti. Queste analisi suggeriscono che altPIDD1 è prodotto a livelli più elevati rispetto a PIDD1. Guardando ai diversi stadi dell'attività ribosomiale, sembra che i ribosomi traducano attivamente altPIDD1 e si raggruppino attorno al suo sito di inizio.

#Misurazione dei Livelli di Proteina

Per determinare i livelli di altPIDD1 e PIDD1 nelle cellule, i ricercatori hanno usato tecniche specifiche che si basano su versioni sintetiche di peptidi. Queste tecniche hanno aiutato a confermare che altPIDD1 è molto più abbondante di PIDD1, con una significativa differenza nella loro stechiometria.

#Testare la Co-Esprimento di altPIDD1 e PIDD1

Per capire meglio come altPIDD1 e PIDD1 vengano espressi insieme, i ricercatori hanno progettato diverse costruzioni genetiche. Alcune costruzioni esprimono solo una proteina, mentre altre permettono l'espressione di entrambe le proteine dallo stesso RNA. Quando entrambe le proteine sono state etichettate, i ricercatori sono stati in grado di osservare direttamente la co-espressione attraverso l'immunoblotting.

I dati hanno mostrato che sia altPIDD1 che PIDD1 sono presenti quando co-espresse dallo stesso RNA. Se il sito d'inizio per altPIDD1 viene rimosso, PIDD1 viene ancora prodotto, confermando il punto di partenza previsto per altPIDD1.

Quando i livelli di espressione di altPIDD1 sono stati confrontati con quelli di PIDD1, altPIDD1 ha mostrato costantemente livelli più alti, anche in condizioni di bassa espressione. Negli esperimenti che impedivano la sintesi proteica, altPIDD1 è rimasto stabile mentre PIDD1 è stato processato più rapidamente. Questo suggerisce che altPIDD1 potrebbe essere prodotto in modo più efficiente dalla macchina cellulare.

#Effetti della Sequenza di Inizio

Negli mammiferi, c'è una sequenza ottimale per iniziare la sintesi proteica nota come il motivo di Kozak. La sequenza attorno ad altPIDD1 fornisce alcuni buoni segnali, ma manca di un nucleotide importante. Di conseguenza, la traduzione di PIDD1 potrebbe dipendere da un processo di scanning "perdente", portando i ribosomi a ignorare il sito di inizio di altPIDD1 e a spostarsi invece sul sito di PIDD1.

I ricercatori hanno testato questa idea modificando il sito di inizio di altPIDD1 per allinearlo con la sequenza ottimale di Kozak. Questa modifica ha portato a livelli ridotti di PIDD1, confermando l'ipotesi dello scanning "perdente".

#Localizzazione di altPIDD1

Per capire dove si trova altPIDD1 nelle cellule, i ricercatori hanno utilizzato tecniche di imaging speciali. Sia altPIDD1 che PIDD1 sono stati localizzati principalmente nel citoplasma. Tuttavia, altPIDD1 è anche apparso in aree distinte lungo i bordi della cellula o in strutture filamentose specifiche, portando i ricercatori a credere che potrebbe connettersi a parti dello scheletro cellulare ricche di una proteina chiamata actina.

Per convalidare queste osservazioni, gli scienziati hanno indotto le cellule a creare strutture che dipendono dall'actina e hanno trovato che altPIDD1 si accumulava in queste aree.

#Interazioni con Altre Proteine

Per scoprire quali proteine interagiscono con altPIDD1 nelle cellule, i ricercatori hanno utilizzato tecniche per purificarlo e analizzare cosa altro fosse presente. È stata identificata una serie di proteine note per essere collegate allo scheletro cellulare. Una proteina, chiamata calpain-2, era particolarmente arricchita nella rete di interazione.

Questa interazione è stata confermata attraverso esperimenti che hanno dimostrato che altPIDD1 poteva legare calpain-2. Poiché calpain-2 ha un ruolo nella cleavage e nel movimento proteico, questa interazione potrebbe essere cruciale per capire cosa fa altPIDD1 all'interno della cellula.

#Il Ruolo di AltPIDD1 nella Morte Cellulare

AltPIDD1 contiene anche un sito dove può essere tagliato da enzimi specifici durante un tipo di morte cellulare programmata chiamata apoptosi. I ricercatori hanno testato questo inducendo la morte cellulare e verificando se altPIDD1 venisse tagliato. Hanno trovato che il trattamento UV portava a un taglio significativo di altPIDD1, che veniva bloccato quando era presente un inibitore specifico. Una mutazione progettata per prevenire il taglio ha confermato questa funzione, rafforzando l'idea che altPIDD1 sia coinvolto nel processo di morte cellulare.

#Evoluzione di altPIDD1

Esaminando l'albero evolutivo del gene PIDD1, i ricercatori hanno scoperto che altPIDD1 è per lo più conservato nei mammiferi placentati. Tuttavia, non appare in altri tipi di mammiferi, suggerendo che questa proteina alternativa sia emersa dopo l'evoluzione dei mammiferi placentati.

#Conclusione

La traduzione di proteine da ORF alternativi sta guadagnando attenzione mentre i ricercatori scoprono nuove proteine che erano precedentemente non riconosciute. Il nostro studio ha dimostrato che il gene PIDD1 produce una proteina alternativa, altPIDD1, che è il principale prodotto di questo gene, non la tradizionale proteina di riferimento.

Utilizzare varie fonti di dati e rianalizzare studi esistenti può fornire preziose intuizioni su queste proteine alternative. Questo studio evidenzia la necessità di un'esplorazione ulteriore dei geni multicoding per comprendere meglio i loro contributi al panorama proteico più ampio nelle nostre cellule.

#Direzioni Future

Per comprendere appieno la funzione di altPIDD1, è necessaria ulteriore ricerca. È essenziale indagare su come la sua presenza influisca su PIDD1 e sui processi cellulari più ampi che coinvolgono le proteine con cui interagisce. Rimuovere altPIDD1 selettivamente aiuterà a chiarire i suoi ruoli specifici all'interno della cellula e determinare se svolge effettivamente una funzione essenziale o se è semplicemente un sottoprodotto della macchina cellulare.

Questo studio pone le basi per ulteriori ricerche sull'importanza delle proteine alternative e sui loro ruoli nella salute e nella malattia. Utilizzando tecniche avanzate e un approccio collaborativo, gli scienziati possono svelare ulteriormente i misteri dell'espressione genica e della funzione proteica negli organismi viventi complessi.